青藏高原東緣高原鼢鼠種群抗藥性評估

譚宇塵，韓天虎，許國成，魏彥明，蔡志遠，王 纏，姚寶輝，郭懷亮，蘇軍虎

（1. 甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省草原技術推廣總站，甘肅 蘭州 730020；3. 甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070；4. 甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，中美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

抗藥性是指藥物在治療疾病或病癥時藥物治療效果降低，是生物對周圍所處環境的變化和化學藥品影響而做出自身適應的結果[1-2]。生物會形成獲得性耐藥性，即在藥物的使用過程中，由于藥物反復投喂，用藥量不足或濫用藥物導致其對藥物產生了抵抗[2]。化學方法防治嚙齒動物過程中，通常使用急性殺鼠劑、生物類蛋白殺鼠劑和抗凝血劑類殺鼠劑[3]。抗凝血劑類殺鼠劑是典型的慢性殺鼠劑，對家畜和鳥類毒害作用小，是最為廣泛應用的一類殺鼠劑[4-5]。長期使用抗凝血劑類藥物對嚙齒動物進行防治會使其產生拒食、代謝應對以及基因突變等行為、生理和遺傳等抗性機制[6-8]。Boyle和Mary[9]在瑞典檢測出有部分鼠類在抗凝血劑類藥物投喂過程中有抗藥性產生，此后西歐和北美也檢測到抗性種群的產生。19世紀50年代起，我國開始使用抗凝血劑類藥物控制嚙齒動物，在抗凝血劑類藥物對害鼠的防治過程中多次檢測到害鼠產生抗藥性[10]。

抗凝血劑類藥物的作用方式是通過抑制維生素K環氧化物復合物還原酶亞基1 (vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，Vkorc1)來抑制血液的凝固，增加血管的通透性，使嚙齒類動物內出血而死亡[11-12]。Vkorc1基因突變中已有5種特異性氨基酸突變使嚙齒類動物對抗凝血劑類藥物有抗藥性，從而構成了嚙齒動物的抗性個體，Vkorc1基因突變使不同地區的嚙齒動物種群出現不同程度的抗性[13]。了解Vkorc1基因序列變異及對其編碼蛋白質的結構突變，是研究嚙齒動物是否產生抗藥性的方法之一。研究發現，具有遺傳基礎的抗藥性與Vkorc1基因的外顯子突變有關[14]，已檢測出的嚙齒動物體內Vkorc1氨基酸的多態性Ser56Pro、Trp59Arg、Phe63Cys、Leu120Gln和Tyr139Cys會增加對抗凝血劑類藥物的抗藥性[15]。

高原鼢鼠(Eospalax baileyi)隸屬于嚙齒目、鼴形鼠科、鼢鼠亞科、鼢鼠屬，是青藏高原特有的物種之一，在繁殖活動時期大量啃食作物根莖、樹皮草根等，采食植物的地下根系，也常將植物地上部分的莖葉拖入洞道內食用或作巢內鋪墊之用，對農作物和牧區造成嚴重的影響[16]。長期以來人們對高原鼢鼠多采用藥物防控和人工捕捉的方式，防控藥物多采用溴敵隆(鼢鼠靈)等抗凝血劑類藥物[11]，但有關高原鼢鼠抗藥性監測的研究缺乏。科學有效掌握高原鼢鼠的抗藥性情況，對高原鼢鼠的管理具有重要意義。本研究在青藏高原東緣的天祝、甘南等地采集了有抗凝血藥物投放歷史的870只高原鼢鼠樣本，檢測高原鼢鼠Vkorc1基因第一外顯子、第二外顯子和第三外顯子，分析了其核苷酸變異情況，并結合已發現的抗藥性變異位點結合分析其抗藥性，評估青藏高原地區高原鼢鼠種群抗性水平，旨在為青藏高原地區高原鼢鼠的科學有效管理提供參考[10]。

1 材料與方法

1.1 高原鼢鼠樣本采集

于2017-2018年，在青藏高原東緣的武威市天祝藏族自治縣、甘南藏族自治州的碌曲、合作、臨潭和卓尼縣和定西市岷縣等有抗凝血藥物投放10年以上的地區，弓形夾捕捉高原鼢鼠，稱重后按體重來鑒別年齡信息[17]，選擇全部為成年以上的個體，總的比例雌雄各半，采集尾端樣本(尾巴末端3～4 cm的部位)經烘干后室溫保存。所有高原鼢鼠參考相關文獻進行經物種鑒別后，再進行Vkorc1基因測序[18]，具體樣地信息如表1所列。

1.2 引物設計試驗方法

1.2.1 引物設計

通過將高原鼢鼠的DNA序列與在NCBI上已發表的褐家鼠序列(NM_203335.2)和親緣關系較近的同科物種裸鼴鼠(Heterocephalus glaber)序列(XM_004856224.3)的Vkorc1基因序列進行序列對比分析。用Primer3Input (Version 0.4.0) 軟件對高原鼢鼠Vkorc1基因外顯子可能存在SNP的片段設計引物(表2)。引物序列由西安擎科澤西生物科技有限有限公司合成。

表 2 高原鼢鼠3個外顯子部位引物序列Table 2 Primers sequence of 3 exons in plateau zokor

1.2.2 PCR擴增產物處理及基因型分析

PCR擴增產物初步經聚丙烯酰胺凝膠電泳SSCP-PAGE檢測樣本基因型的SNP。利用已成功擴出的Vkorc1基因的3個外顯子進行擴增。反應包含10 × buffer緩沖液，0.5 μL的dNTP，0.3 μL的Taq DNA聚合酶，1 μL的引物和1 μL的模板DNA，反應體系為25 μL。

1.3 數據分析

高原鼢鼠Vkorc1基因外顯子PCR結果使用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，PCR產物經非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳SSCP-PAGE篩選過后送至西安擎科澤西生物技術有限公司進行測序。所得高原鼢鼠Vkorc1基因外顯子測序結果用OLIGO7.0進行編輯比較。

高原鼢鼠Vkorc1氨基酸突變位點使用MEGA7.0進行比對分析，所得突變的高原鼢鼠氨基酸三維模型使用SWISS-MODEL進行預測細化和評價，并使用GOR IV對蛋白質二級結構檢查比較[19]。

2 結果

2.1 高原鼢鼠Vkorc1基因外顯子擴增

高原鼢鼠Vkorc1基因外顯子PCR結果使用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，得到高原鼢鼠3個外顯子基因序列，第一外顯子為147 bp，第二外顯子為106 bp，第三外顯子為157 bp (圖1)。所得到合適的高原鼢鼠Vkorc1外顯子使用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，得到了高原鼢鼠3個外顯子的SNP(圖2)。

圖 1 圖1高原鼢鼠外顯子PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果Figure 1 Agarose gel electrophoresis results of Vkorc1 exons 1-3 PCR products in plateau zokor

圖 2 高原鼢鼠3個外顯子聚丙烯酰胺凝膠電泳SNP結果Figure 2 SNP results of polyacrylamide gel electrophoresis in three exons of plateau zokor Vkorc1

2.2 高原鼢鼠Vkorc1基因外顯子多態性SNP分析

在全部870個高原鼢鼠樣本的Vkorc1基因外顯子多態性結合測序圖譜分析，得出各基因型突變位點及突變頻率(表3)，以及高原鼢鼠不同地區外顯子基因型數量分布(表4)。

表 3 高原鼢鼠Vkorc1基因外顯子多態性突變位點及突變頻率Table 3 Polymorphic mutation sites and frequency of Vkorc1 gene exons 1-3 in plateau zokor

2.3 高原鼢鼠Vkorc1氨基酸序列檢測及抗藥性

使用SWISS-MODEL進行分析發現，在870個高原鼢鼠個體中，有197個個體發現Vkorc1氨基酸序列與野生型有差異(圖3)。

Vkorc1基因3個外顯子中第一外顯子BB基因型，第二外顯子AB基因型，第三外顯子BB基因型這3種最常見的基因型在每一個受樣地的樣本中占很大比例。天祝、碌曲、臨潭和卓尼地區檢出了全部的基因型，其中包括導致抗性發生的Phe63Cys氨基酸突變。這種Vkorc1氨基酸的突變的三維模型預測到Phe63Cys的側鏈沖突而導致蛋白質空間構象的改變。Vkorc1基因第三外顯子BB基因型中對比褐家鼠有氨基酸突變Ala143Val，這種基因型的突變也能導致蛋白質空間構象的改變(圖4)。合作地區檢測出了Gly19Glu和Leu114Ile的氨基酸突變，但缺少Arg61Pro氨基酸突變的基因型和能致抗性發生的Phe63Cys氨基酸突變基因型(表5)。

表 4 高原鼢鼠不同地區外顯子基因型數量分布Table 4 SNP results of polyacrylamide gel electrophoresis in three exons of plateau zokor Vkorc1

圖 3 高原鼢鼠Vkorc1基因4個單核苷酸多態性位點Figure 3 Four single nucleotide polymorphic loci of Vkorc1 gene in plateau zokor

圖 4 高原鼢鼠的維生素K環氧還原酶的三維模型Figure 4 Three-dimensional model of vitamin K epoxide reductase in plateau zokor

表 5 高原鼢鼠檢測到的4個氨基酸變異的概況Table 5 Overview of the four Vkorc1 amino acid variants detected in plateau zokor

在氨基酸突變的基因型遺傳偶聯上發現，在碌曲和合作樣地的樣本中共有52只互為親緣關系的高原鼢鼠，并發現其中有11只的第一外顯子雜合子AC基因型的交換組合，以及有7只第一外顯子的雜合子BC基因型的Gly19Glu氨基酸突變。第一外顯子的雜合子BC基因型在與其他氨基酸序列交換時僅在2只高原鼢鼠中檢測到，第三外顯子的雜合子AB基因型在與其他氨基酸序列交換時在8只高原鼢鼠中檢測到。

結合DNA-PCR產物測序和PCR-SSCP方法，經過MAGA7.0軟件比對分析結果發現，在高原鼢鼠目標群體中VKORC1基因外顯子翻譯區序列有4個種間突變位點，對比褐家鼠序列，高原鼢鼠有18個錯義突變位點，第一外顯子有8個氨基酸突變位點(Ser7Asn、Arg10Trp、Leu11Val、Leu17Val、Leu20Phe、Asn36Asp和Glu37Lys)；第二外顯子有3個氨基酸突變位點(His68Pro、Ala72Met和Ile90Leu)；第三外顯子有8個氨基酸突變位點(Gly99Val、Ile107Val、Leu108Val、Val114Leu、Leu118Val、Ala143Val、Met146Thr和Leu147Trp)。在記錄的其他4種能導致嚙齒動物產生抗藥性基因型的氨基酸突變(Ser56Pro、Trp59Arg、Leu120Gln、Tyr139Cys)，在高原鼢鼠中未檢測到(圖5)。870只高原鼢鼠中大多數都匹配裸鼴鼠Vkorc1基因的外顯子序列，然而89.2%的高原鼢鼠在第一外顯子具有Pro8Pro、Gly9Gly、Arg12Arg和Gly46Gly同義SNP，95.2%高原鼢鼠在第二外顯子具有Gly64Gly、Trp66Trp和Glu67Glu同義SNP，88.2%高原鼢鼠在第3外顯子具有Arg99Arg同義SNP。

有41只高原鼢鼠有與Phe63Cys突變相關的核苷酸置換，顯示出抗藥性發生情況，占全部高原鼢鼠的4.8%，其中天祝有2只，抗性發生率為1.0%(n = 208)，碌曲種群檢測到10只，抗性發生率為6.3% (n = 159)，臨潭種群有10只，抗性發生率為6.7% (n = 150)，卓尼種群有8只，抗性發生率為12.9% (n = 62)，岷縣種群有11只，抗性發生率為5.5% (n = 200) (表4)。

圖 5 高原鼢鼠對比褐家鼠氨基酸錯義突變位點Figure 5 Comparison of amino acid missense mutation sites between plateau zokor and Rattus norvegicus

3 討論

本研究發現，青藏高原東緣高原鼢鼠Vkorc1基因3個外顯子具有多態性位點，以及Vkorc1氨基酸序列的發生的突變，根據氨基酸序列分析，結合已知突變位點和抗藥性的相關性，說明Vkorc1基因介導的維生素K還原氧化酶的改變使高原鼢鼠對抗凝血劑類藥物具有抗藥性，并初步發現了4個抗性(地理)種群。

3.1 高原鼢鼠Vkorc1基因 Phe63Cys基因型的突變影響抗藥性

研究發現嚙齒類動物具有5個產生抗藥性的氨基酸位點，關鍵位點的氨基酸取代可能會干擾底物或成為Vkorc1酶的抑制劑，對抗凝血劑類藥物產生活性的改變。而蛋白表達分析Vkor酶更能準確地反映高原鼢鼠體內檢測到的抗性條件，從而發現這些Vkorc1基因突變與物種是否無關。對高原鼢鼠的這五個氨基酸位點進行檢測發現，在天祝、碌曲、臨潭、卓尼和合作美吾捕獲的高原鼢鼠中都檢測出了Vkorc1氨基酸的Gly19Glu、Arg61Pro、Phe63Cys和Leu114Ile的錯義突變位點。在天祝、碌曲、臨潭和卓尼地區的539只高原鼢鼠中部分樣本的Vkorc1基因攜帶純合子Phe63Cys基因型。研究發現影響挪威鼠(Rattus norvegicus)對抗凝血劑類藥物產生抗性相應突變的個體中顯示，攜帶純合子Phe63Cys的嚙齒類動物對抗凝血劑類藥物有較強的抗性[19]。且Phe63Cys突變在屋頂鼠(Rattus rattus)體內表達比較大時，使Vkorc1酶活性低于正常屋頂鼠(野生型)體內酶的表達水平，并導致其抗藥能力提高6倍[20]。

在其他嚙齒動物中已有報道，并在高原鼢鼠Vkorc1基因序列中發現的單核苷酸突變(Phe63Cys)，已證明與抗凝血類藥物的抗藥性有關，但所檢測出的抗性高原鼢鼠數量在所有檢測樣本中占4.8%，說明已出現抗性個體但尚未形成抗性種群。在美吾、則岔、尕海和果芒等地高原鼢鼠與褐家鼠種間比較發現氨基酸不同，在其他嚙齒類中未見報道。在高原鼢鼠中發現的5種氨基酸突變中，但這5種氨基酸突變與抗凝血類藥物的抗藥性沒有關系。研究發現，嚙齒動物雖會產生同義替換，但不會對抗凝血劑類藥物產生抗藥性。此外，Phe63Cys的突變比例并不高[21]。本研究發現，只有41只高原鼢鼠有與Phe63Cys突變相關的核苷酸置換，占全部高原鼢鼠的4.8%，41只高原鼢鼠中有2只分布在天祝，10只分布在碌曲，10只分布在臨潭，8只分布在卓尼，11只分布在岷縣。這對于當地高原鼢鼠種群數量的控制是一種挑戰，在有抗性高原鼢鼠個體產生的情況下，當地應使用多種不同的藥物來控制高原鼢鼠。或是從已檢測到相關氨基酸Phe63Cys突變的地方捕獲活的高原鼢鼠，通過凝血反應測試來驗證高原鼢鼠的實際抗性情況[22]。

3.2 高原鼢鼠Vkorc1基因其他基因型的突變影響抗藥性

全球許多國家都有關于嚙齒類動物對抗凝血劑類藥物產生抗藥性的研究。通常抗凝血劑類藥物誘餌的廣泛應用和重復使用，以及誘捕實踐的效率低下，被認為是產生廣泛抗藥性的原因之一。Vkorc1基因突變是嚙齒類動物對抗凝血劑類藥物產生抗藥性的主要原因之一，這種基因突變可與維生素K依賴性凝血因子缺乏相關[23]。一種方法是對嚙齒類動物的Vkorc1基因進行變異位點分析，從而發現是否有其基因在抗凝血類藥物的使用中出現了突變，從而解析出嚙齒動物對抗凝血劑類藥物是否產生抗藥性[24-25]。另一種方法則是用嚙齒類動物Vkorc1基因序列介導翻譯的氨基酸在畢赤酵母中的表達和抑制常數，來測定嚙齒類動物對抗凝血劑類藥物的抗藥性[26]。

研究表明，Vkorc1基因中其他許多突變也可使嚙齒類動物對抗凝血劑類藥物產生抗藥性。如Buckle等[27]發現，在褐家鼠Vkorc1基因上的第139位酪氨酸產生變異的個體均會對抗凝血劑類藥物產生不同程度的抗藥性。Buckle等[28]發現Vkorc1第一外顯子基因序列在第74個堿基上發生A ＞T堿基替換的變異也會導致氨基酸的突變，這種突變可能通過改變蛋白質的螺旋結構造成蛋白質部分功能的缺失，從而導致嚙齒類動物對各種抗凝血劑類藥物產生抗藥性。本研究中，在臨潭和天祝所捕獲的高原鼢鼠樣本中均未有這種突變發生。在其他研究中，尚未發現Vkorc1基因序列和Vkorc1表達的氨基酸序列中與抗凝血抗藥性相關的其他基因型突變[29]。

3.3 高原鼢鼠抗藥性分子檢測及其治理

嚙齒類抗藥性傳統的檢測多用敏感性測定，該方法需要進行捕捉、飼養和適口性分析等[2]，很難進行大規模的種群抗性評估，而生理生化酶活性的測定方法也需要進行采集血樣等進行分析，亦具有過程復雜等特點。隨著分子生物學技術的發展，獲得嚙齒動物DNA的技術和手段日趨完善和簡便，這為分子檢測提供了極大的便利。本研究在前期研究的基礎上，候選溴敵隆的抗性基因，并結合已知的變異及其抗藥相關性，首次對青藏高原東緣8個地理種群近900只個體進行了檢測，較全面的掌握了高原鼢鼠的抗性情況。但對來自新型Vkorc1基因變異群體的嚙齒類動物進行血凝反應測試闡明其抗藥性狀況，還需要進一步研究以確定其抗藥性機制。同樣，其他Vkorc1基因型的改變也可能在其他嚙齒動物對抗凝血劑類藥物產生抗藥性中發揮作用。在分子抗性水平上的其他研究發現，細胞色素氧化酶P450 (Cytochrome P450, P450)基因的突變也可導致嚙齒類動物的抗藥性增加。抗凝血劑類藥物主要由細胞色素P450基因編碼的酶參與的新陳代謝被代謝出體外。截至目前，細胞色素P450 CYP2C9 (Cytochrome P450 2C9)基因中有30多個等位基因的等位變異與酶的活性有關，因此具有CYP2C9野生型等位基因的個體更易對抗凝血劑類藥物敏感[30]。同樣，常見的攜帶有CYP2C9純合基因型的抗凝血劑類藥物給予劑量要高于CYP2C92和CYP2C93等其他基因型[31]。通過對細胞色素P450基因進行擴增和測序，可以確定高原鼢鼠是否有因P450基因上的表達異常而對藥物產生抗藥性。

一旦停止對抗凝血劑類藥物的廣泛使用，對溴敵隆等其他抗凝血劑類藥物有抗藥性的個體就可以從種群中逐步淘汰出來。在對挪威鼠的抗藥性檢測中有證據表明，當停止使用抗凝血劑類藥物時，嚙齒類動物種群的抗性基因頻率會逐年下降[32]，攜帶抗藥性基因的嚙齒動物的增速度下降，從而影響到它們的大規模繁殖。然而，另一項研究發現，對抗凝血劑類藥物抵抗能力強的個體比對藥物敏感強性的的個體體重更重，在沒有藥物選擇壓力的情況下，攜帶抗藥性基因的嚙齒類動物種群數量并沒有發生太大的變化[33]。使用交叉使用類藥物或是間斷使用抗凝血劑類藥物，都可以預防或減輕高原鼢鼠對抗凝血劑類藥物的抗藥性，這將為抗藥性的解決提供理論依據。因此，針對抗藥性種群的出現，首先進行必要的抗藥性監測，在認識抗性種群結構和抗性水平的基礎上采用藥物輪換使用，或使用生物防治如加大采用C型、D型肉毒素的防治或引入狐貍(Vulpes)、鷹(Accipiter)天敵等其他防治方法，都能有效控制高原鼢鼠的種群數量。其次從環境治理方面，結合草地管理措施開展(清理高原鼢鼠的活動繁殖場所，或者通過草地改良補播等)基礎綜合控制和防治重點場所設施的完善，或者開展新藥和新劑型的發展[34]，都可以對高原鼢鼠的種群數量進行有效的控制。