響應面優化白芨水溶性多糖提取工藝的研究

唐 森，梁冰娜，覃逸明， 吳國勇，張 鵬

(1.廣西科技師范學院食品與生化工程學院，廣西 來賓 546119;2.廣西科技師范學院特色瑤藥資源研究與開發重點實驗室，廣西 來賓 546119;3.廣西科技師范學院 科研管理處，廣西 來賓 546119)

白芨Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.]是蘭科白芨屬的一種多年生草本植物，又名為白根、羊角七、冰球子、白烏兒頭、地螺絲、白雞兒、白雞娃、連及草等。地下有粗厚的根狀莖，如雞頭狀，富粘性，含白芨膠質，即白芨甘露聚糖，可供藥用，有收斂止血、生肌止痛之效，也可供作糊料，花美麗，也可供觀賞。產地主要在我國廣西、貴州、云南、四川、陜西南部等，白芨是蘭科白芨屬的藥用植物，對細菌和其他病原菌微生物均有抑菌和殺菌作用[1-3]。白芨中的有效成分主要為中性雜多糖,白芨多糖是由β-( 1→4)-甘露糖、β-( 1→4)-葡萄糖和α-( 1→6)葡萄糖殘基組成的中性雜多糖[4-5]。根據文獻報道，白芨多糖具有抗腫瘤和增強機體免疫等作用，可作為功能性食品成分及膳食營養補充劑，此外白芨中其他主要化學成分中的物質，具有抗炎癥、延緩衰老及促進創傷愈合作用等功效[6]。由此可見，白芨多糖蘊含著豐富的藥理活性，多糖提取是國內外學者感興趣的研究熱點之一，本試驗采用水作為提取試劑，通過水浴提取法提取白芨水溶性多糖，對液料比、提取溫度、提取時間對白芨多糖提取率的影響展開研究，并通過響應面法優化，確定最佳提取工藝，為白芨多糖進一步在各個領域的開發利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白芨購于廣西來賓市桂中大藥房，經廣西科技師范學院特色瑤藥資源研究與開發重點實驗室張鵬博士鑒定為白芨，試驗所用葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇、正丁醇、三氯甲烷均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

FW135 中草藥粉碎機( 天津市泰斯特儀器有限公司)；FA2004B 型電子分析天平( 上海越平科學儀器有限公司)；HH-S4 型恒溫水浴鍋(金壇市醫療儀器廠)；KQ-300DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHZ-D(III)循環水多用真空泵(鞏義市科瑞儀器有限責任公司)；C-20玻璃儀器氣流烘干器(上海貝侖儀器設備有限公司)；H3-20KR臺式高速冷凍離心機(湖南可成儀器設備有限公司)；UV-9600紫外/可見分光光度計(北京北分瑞利分析儀器(集團)公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 白芨原材料前處理

將白芨片平鋪于烘盤內，置于70℃的熱恒溫鼓風干燥箱中干燥至恒重，利用中草藥粉碎機將烘干后的白芨片破碎，并過40目篩網，裝入密封袋備用。

1.3.2 白芨水溶性多糖的提取

以蒸餾水作為提取溶劑，準確稱取白芨粉末1.0 g置于三角燒瓶中，水浴加熱提取，按照試驗所需的液料比、提取時間和提取溫度進行提取，水浴提取后，放入冷水中迅速冷卻至室溫，過濾，收集提取液，定容，得到供試品溶液。

1.3.3 標準曲線的繪制

參照張翰韜等[7]的方法并稍作修改，用電子分析天平準確稱取無水葡萄糖標準品0.0100 g，加入蒸餾水進行溶解，然后轉移至規格100 mL容量瓶中，定容后充分搖勻，即可得到100 μg·mL-1葡萄糖對照品溶液，放置于4℃冰箱儲存備用。

用移液槍移取葡萄糖對照品溶液0，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 mL，分別置于具塞試管中，并分別加入蒸餾水2.0，1.7，1.6，1.5，1.4，1.3，1.2，1.1 mL，再加入1 mL質量分數為6%的苯酚溶液，搖晃均勻后迅速加入5.0 mL的濃硫酸(與液面垂直加入，勿接觸試管壁，以便與反應液充分混合)，搖勻后在室溫下放置5 min，然后將具塞試管放置于40℃水浴鍋中反應20 min，取出迅速用冷水冷卻至室溫。另以蒸餾水2.0 mL，同以上操作作空白對照，在最大吸收波長(490 nm)處測定吸光度值。然后以葡萄糖質量濃度為橫坐標(X，μg·mL-1)，吸光度值(Y)為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。得回歸方程Y=0.0832x-0.1704，R2=0.9994，表明線性關系良好。

1.3.4 白芨多糖提取的測定

參照張翰韜等[7]的方法并稍作修改，移液槍吸取上述所得供試品溶液2 mL于100 mL的容量瓶中，加入適量蒸餾水進行定容，搖晃均勻后精密吸取20 mL稀釋液于離心管中，加入4 mL Savage試劑(V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1)，使供試品稀釋液與Savage試劑體積比為5∶1，搖勻，放入離心機中在2000 r·min-1條件下離心20 min，離心后取2 mL上清液轉移至干凈的具塞試管中，按1.3.4中方法測定吸光度，將吸光度值帶入線性回歸方程，計算出粗多糖溶液的濃度ρ，再按式計算出樣品中多糖提取率：

式中：ρ為粗提物樣液葡萄糖質量濃度(μg·mL-1)；D為稀釋倍數；m為樣品質量(μg)；V為最初樣品定容體積即液料比體積，mL。

1.3.5 單因素考察試驗

本次實驗選取蒸餾水作為提取溶劑，采用水浴加熱法提取白芨水溶性多糖，考察提取溫度、提取時間、液料比三個因素對白芨水溶性多糖提取率的影響。

1.3.5.1 提取溫度對白芨水溶性多糖提取率的影響

稱取經前處理后的白芨1.0 g于三角燒瓶中，固定液料比為100∶1 mL·g-1，提取時間為4 h，分別設定提取溫度為50，60，70，80，90℃，經水浴提取后，迅速取出放置冷水槽中快速冷卻至室溫，過濾，按“1.3.4”中的方法測定白芨水溶性多糖提取率，每組進行3次平行試驗，計算白芨水溶性多糖提取率，確定最佳提取溫度。

1.3.5.2 提取時間對白芨水溶性多糖提取率的影響

稱取經前處理后的白芨1.0 g于三角燒瓶中，固定液料比為100∶1 mL·g-1，提取溫度為80℃，分別設定提取時間為3，3.5，4，4.5，5 h，經水浴提取后，迅速取出放置冷水槽中快速冷卻至室溫，過濾，按“1.3.4”中的方法測定白芨水溶性多糖提取率，每組進行3次平行試驗，計算白芨水溶性多糖提取率，確定最佳提取時間。

1.3.5.3 液料比對白芨水溶性多糖提取率的影響

稱取經前處理后的白芨1.0 g于三角燒瓶中，分別按液料比為70∶1，80∶1，90∶1，100∶1，110∶1 mL·g-1加入蒸餾水，用封口膜封口(防止在水浴加熱時，水分揮發，影響試驗值)，置于80 ℃的水浴鍋中水浴4h，經水浴提取后，迅速取出放置冷水槽中快速冷卻至室溫，過濾，按“1.3.4”中的方法測定白芨水溶性多糖提取率，每組進行3次平行試驗，計算白芨水溶性多糖提取率，確定最佳液料比。

1.3.6 響應面法優化試驗

在單因素試驗基礎上，選取(A)提取溫度、(B)提取時間、(C)液料比三個影響因素為自變量，白芨水溶性多糖提取率(Y)為響應值，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理[8-9]進行3因素3水平的二次多項回歸組合響應面試驗，確定提取白芨水溶性多糖的最佳工藝條件，試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面因素水平編碼

1.3.7 驗證實驗

選取響應面試驗分析得出的最佳工藝參數作為提取條件，3次重復試驗實驗結果以均值SD表示，計算多糖提取率，以確定白芨水溶性多糖的最優提取工藝。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取溫度單因素對白芨多糖提取率的影響

如圖1所示，隨著提取溫度的升高，白芨多糖提取量會逐漸升高，原因是溫度的升高加速分子擴散運動速度，有利于多糖的溶解，當提取溫度為80℃時，白芨多糖提取率達到最高峰值，4.23%。當提取溫度低于80℃時，多糖提取量隨提取溫度的升高增加緩慢，提取溫度達到80℃，多糖提取量會顯著增加，提取溫度高于80℃后，白芨多糖的提取率隨提取溫度上升而下降。說明提取溫度過高，影響白芨多糖生理活性，繼續升高溫度只會引起部分多糖降解，繼而影響白芨多糖的提取率。因而確定本試驗采用的水提法提取白芨多糖最佳提取溫度為80℃。

圖1 提取溫度對白芨水溶性多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction rate of water-soluble polysaccharides from Scutellaria baicalensis

2.1.2 提取時間單因素對白芨多糖提取率的影響

提取時間對白芨水溶性多糖提取率的影響如圖2所示，當提取時間由3 h至4 h時，隨著提取時間的增加，白芨水溶性多糖提取率明顯增加，原因是隨著時間的延長，白芨多糖能在水中得到充分溶解，提取量不斷上升。提取時間在4 h時，白芨多糖的提取率達到最高值，4.23%。當提取時間長于4 h后，白芨多糖提取量反而下降。綜合整體能耗及經濟因素考慮，確定本試驗的最佳提取時間為4 h。

圖2 提取時間對白芨水溶性多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of water-soluble polysaccharides from Scutellaria baicalensis

2.1.3 液料比單因素對白芨多糖提取率的影響

圖3 液料比對白芨水溶性多糖提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on extraction rate of water-soluble polysaccharides from Scutellaria baicalensis

液料比對白芨水溶性多糖提取率的影響如圖3所示，液料比在70∶1～100∶1 (mL·g-1)區間時，隨著提取溶劑體積的增大，白芨水溶性多糖提取率隨液料比的增大而急劇上升，液料比為100∶1 (mL·g-1)白芨多糖提取率達到峰值，4.23%。當繼續增大液料比時，白芨多糖提取率隨液料比的增大而呈緩慢下降趨勢。因此確定本試驗采用的水提法提取白芨多糖的最佳液料比為100∶1 (mL·g-1)。

2.2 響應面法試驗結果

2.2.1 試驗設計方案結果及回歸方程的建立

根據Box-Behnken試驗設計原理，依據單因素試驗結果，確定提取溫度(A)、提取時間(B)和液料比(C)3個因素，以白芨水溶性多糖提取率(Y)為指標，設計三因素三水平的Box-Behnken試驗，中心點設計5個重復，試驗設計方案及結果見表2。

表2 BOX-BEHNKEN試驗設計及試驗結果

應用Design expert8.0.6.1軟件對表2試驗數據進行回歸分析，并因此得出白芨水溶性多糖提取率(Y)對提取溫度(A)、提取時間(B)和液料比(C)的二元多項回歸方程：Y=4.26+0.0075A+0.084B+0.049C-0.058AB-0.078AC-0.065BC-0.14A2-0.16B2-0.06C2，相關系數R2=0.9290，說明該二次回歸方程擬合度較好，結果可靠，回歸方程方差分析見表3。

表3 響應面方差分析結果

注：R2=0.9689，R2ADJ=0.9290，注:**差異極顯著(P<0.01);*差異顯著(P<0.05)

由表3方差分析可知，試驗模型的(P=0.0002<0.01)，表明該模型回歸有極顯著差異；失擬值P=0.1149>0.05，表明差異不顯著及建立模型數據成立。R2=0.9689，表明響應值多糖提取率的實際值與預測值之間具有很好的擬合度，可以用來優化和預測白芨多糖最佳提取工藝條件。由二次回歸方程系數的顯著性檢驗可知，二次項的B2(F=66.68)對試驗結果有極其顯著性影響。一次項B、二次項A2及交互項的AC有較顯著影響，剩余有顯著影響，綜合以上因素分析，表明考察因素對白芨多糖的提取率存在交互綜合影響作用。比較F值大小可反映出各因素對指標的影響規律，由表3可知，一次項影響白芨多糖提取率的主次因素為：提取時間>液料比>提取溫度；二次項影響白芨多糖提取率的主次因素為：提取時間>提取溫度>液料比；交互項相互作用的主次順序為：AC>BC>AB。

2.2.2 等高線圖和3D響應面圖分析

為直觀地考查各因素之間交互作用顯著與否，以進一步優化試驗工藝，運用 Design-Expert8.0.6 軟件對白芨多糖提取率響應值分析作圖，得到由響應值A、B、C 因素所構成的三維空間圖及其三維空間在二維平面上的等高線圖。分析結果見圖4-圖6。由相關因素的3D響應面圖及等高線圖結合可看出，提取時間對白芨多糖提取工藝的影響極大，在適宜提取時間下提取率較高，而當提取時間過高時多糖提取率下降明顯。AC之間的交互作用最顯著，BC次之，AB之間交互作用最不顯著。

從圖4可知，提取時間與提取溫度的等高線近似圓形，表明提取時間與提取溫度的交互作用對白芨多糖提取率的影響不顯著。當提取時間固定時，白芨多糖提取率隨溫度的上升呈先增加后降低趨勢；提取溫度不變，隨時間的延長白芨多糖提取率先升高后降低。

圖4 多糖提取率隨時間和溫度變化的響應面與等高線Fig.4 Response Surface and Contour of Polysaccharide Extraction Rate with Time and Temperature

從圖5可直觀看出，當提取時間固定時，隨液料比的增加和提取溫度的上升，白芨多糖提取率先增大后減小。從3D響應面圖及等高線圖結合可看出，等高線圖近似為橢圓可以說明提取溫度和液料比間的交互作用對多糖提取率有影響，且提取溫度變化的曲面比液料比變化的曲面陡，說明提取溫度對響應值的影響大于液料比。

圖5 多糖提取率隨溫度和液料比變化的響應面與等高線Fig.5 Response Surface and Contour of Polysaccharide Extraction Rate with Temperature and Solid-liquid Ratio

圖6中的三維圖形和等高線圖說明了當提取溫度不變時，多糖提取率隨時間的延長和液料比增大呈先增加后降低趨勢。等高線圖近似為橢圓可以說明提取時間和液料比間的交互作用對多糖提取率有影響，圖6的響應面曲面最陡峭，表明響應值對提取時間和液料比兩操作條件的改變越敏感，提取時間因素的交互作用對白芨多糖提取率的干擾性較強。

圖6 多糖提取率隨時間和液料比變化的響應面與等高線Fig.6 Response Surface and Contour of Polysaccharide Extraction Rate with Time and Liquid-to-Material Ratio

2.3 最佳條件的預測以及驗證試驗

通過回歸線性模型計算得最佳的實驗提取條件是：提取溫度78.78℃，提取時間4.10 h，液料比103.77∶1 mL·g-1。結合實際，修正提取條件為提取溫度79℃，提取時間4.10 h，液料比104∶1 mL·g-1進行試驗，并且進行3次平行實驗，白芨多糖的提取率是(4.27±0.05)%。

3 結論

本試驗以水做提取劑，采用水提法提取白芨多糖，使用苯酚-硫酸比色法測定白芨水溶性多糖，考查不同液料比、提取溫度、提取時間三因素對白芨多糖提取率的影響，并通過響應面分析優化試驗設計方案，得出最佳提取工藝條件。最佳的單因素條件為提取溫度80℃，提取時間4.00 h，液料比100∶1 mL·g-1。通過響應面分析優化試驗，用Box-Behnken軟件進行分析，得出二次多項回歸方程：Y=4.26+0.0075A+0.084B+0.049C-0.058AB-0.078AC-0.065BC-0.14A2-0.16B2-0.06C2。最后得出最佳的提取工藝條件是提取溫度79 ℃，提取時間4.10 h，液料比104∶1 mL·g-1，白芨多糖的提取率是(4.27±0.05)%。