香煙提取物對人支氣管上皮細胞抗衰老因子Klotho的影響分析及應對措施的效果研究

楊林，賈欽堯，宋珊

慢性阻塞性肺疾病（簡稱“慢阻肺”）是一種慢性炎性疾病，臨床以持續、進行性發展的氣流受限為主要特征，研究表明其發生與人體過多吸入香煙煙霧或顆粒等有害刺激物引發的氣道炎癥有關［1-2］。氣道上皮是肺與外界接觸的第一道屏障，人支氣管上皮細胞（Human bronchial epithelial cells，HBE）分布于氣管腔內表面，在抵御病原體、有害氣體、過敏原等外來刺激過程中發揮重要作用，對于維持正常的氣道功能具有重要作用，其異常調控會影響肺組織對外來刺激物的防御能力［3-5］。在病理條件下，受到致病因素的反復刺激，HBE細胞會釋放多種炎性介質和趨化因子，使機體局部免疫反應增強，進而活化多種炎癥細胞［6-8］。有研究表明抗衰老因子Klotho在HBE細胞中有著較高的表達量，且其在健康人群中的表達水平高于吸煙人群，在慢阻肺病人中的表達水平偏低［9］。同時外源性重組Klotho蛋白能夠下調白細胞介素（Interleukin，IL）-6、單核細胞趨化蛋白1（Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）mRNA 的 表 達 水平［10］。相關研究認為吸煙可增加慢阻肺的發生風險［11］，因此本研究擬以HBE細胞為研究對象，探討香煙提取物對HBE細胞抗衰老因子Klotho的影響及相關治療措施的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2016年3月至2017年8月在儀隴縣人民醫院進行體檢的健康人員30例作為對照組，其中男20例，女性10例，年齡（61.32±6.78）歲，范圍為45～73歲。選擇同期在該院經肺功能檢查確診的慢阻肺病人30例，除合并高血壓、糖尿病、冠心病、自身免疫系統疾病、癌癥、哮喘、結核病等嚴重疾病，且近2周內未使用茶堿或糖皮質激素，其中男性21例，女性9例，年齡（60.54±6.44）歲，范圍為45～72歲。兩組人群性別比例（χ2＝1.021，P＝0.102）、年齡（t＝0.812，P＝0.412），差異無統計學意義。HBE細胞購于北京腫瘤研究所。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2 香煙提取物制備取兩根剪去過濾嘴的香煙，在改良的注射器驅動裝置一端點燃，使香煙燃燒產生的煙霧以50 mL/min的速度通過該裝置，并使其溶在10 mL 1640培養基中。之后調節溶液PH值為7.4，再以0.22 μm微孔濾器過濾。香煙提取物需現用現制，并保證每次在制備后的30 min內開始使用。上述方法制備的香煙提取物為100%，使用時以1640培養基稀釋至合適濃度。

1.3 細胞培養及處理HBE細胞使用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養基培養，在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件下常規培養，每2～3天進行1次傳代，在細胞對數期進行實驗。

取對數生長期HBE細胞，以2×105/mL的密度接種于6孔板，分為對照組（A組），模型組（B組），陽性對照組（C組），地塞米松低劑量組（D組）、地塞米松中劑量組（E組）、地塞米松高劑量組（F組）（其中D、E、F組為實驗組），每組設3個復孔，共3塊6孔板。陽性對照組和實驗組在常規培養24 h后加入1%香煙提取物處理24 h，之后陽性對照組給予外源性200×10-12mol/L Klotho蛋白處理，實驗組分別在共培養1 h后分別給予1×106mol/L，1.5×106mol/L和2×106mol/L的地塞米松。

1.4 觀察指標及方法 （1）健康與慢阻肺人群外周血細胞因子mRNA表達檢測，采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測兩組外周血細胞因子IL-8、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、Klotho表達水平。（2）ELISA檢測不同刺激條件下HBE細胞釋放炎性因子水平，收集藥物處理24 h及對照組細胞培養上清液，-20℃保存，測定時從冰箱取出試劑盒，在室溫下平衡，各孔分別加入50 μL樣品或標準品，輕輕混勻1 min，以密封膜密封，25℃孵育2 h；之后倒掉板內液體，每個孔中加入250 μL洗滌液洗滌，再次倒掉液體，反復洗滌5次，最后拍干。之后依次進行加50 L生物素標記抗體于樣品或標準品孔內，洗板，加100 L辣根過氧化物酶標記的抗生物素鏈菌素（Streptavidin-HRP）酶聯二抗溶液于各孔，用密封膜封住板孔，37 ℃孵育45 min；洗板，加100 L 3，3’，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）底物溶液，室溫避光反應孵育30 min；每孔分別加入100 μL終止反應液；使用酶標儀在450 nm波長處測定。（3）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測不同刺激條件下HBE細胞釋放炎性因子mRNA水平，收集藥物刺激3 h及對照組細胞樣品，每個樣品加入1 mL Trizol試劑，吹打收集細胞樣品于1.5 mL無RNA酶離心管，指彈，室溫靜置15 min，存放于-20℃保存備用。測定時，采用RNA提取試劑盒提取RNA，并反轉錄得到cDNA，最后采用RT-qPCR進行測定。引物由Invitrogen公司合成，引物序列如下，Human IL-8：sense，5′-CTCTTGGCAGCCTTCCTGATT-3′Antisense，5′-TATGCACTGACATCTAAGTTCTTTAGCA-3’；Human IL-6：sense，5′-AGCCCTGAGAAAGGAGACATGTA-3′Antisense，5′-CATCTTTGGAAGGTTCAGGTTGT-3′。

1.5 統計學方法采用SPSS 22.0軟件進行數據處理，計量資料滿足方差齊性和正態分布，采用xˉ±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，在方差分析有意義的基礎上，再采用LSD-t檢驗進行多組間的兩兩比較；計數資料采用χ2檢驗。均以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 健康與慢阻肺人群外周血細胞因子檢測慢阻肺病人外展血IL-8，IL-6及TNF-α含量均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；慢阻肺病人外周血Klotho蛋白含量顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 健康與慢阻肺人群外周血細胞因子檢測/（pg/mL，xˉ±s）

2.2 ELISA檢測各組HBE細胞炎性因子表達水平 如下表2所示，單因素方差分析結果顯示，各組間IL-8、IL-6和TNF-α均差異有統計學意義（P＜0.05），經LSD-t檢驗組間兩兩比較結果顯示，B組細胞上清液中IL-8、IL-6、TNF-α表達水平顯著高于A組，差異有統計學意義（P＜0.05）。B組細胞上清液中IL-8、IL-6、TNF-α表達水平高于D、E、F組，均差異有統計學意義（P＜0.05）。D、E、F組細胞上清液中IL-8、IL-6、TNF-α含量依次降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 ELISA檢測各組HBE細胞培養上清液中炎性因子含量/（pg/mL，xˉ±s）

2.3 RT-PCR檢測各組HBE細胞炎性因子表達水平如下表3所示，單因素方差分析結果顯示，各組間IL-8 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達水平均差異有統計學意義（P＜0.05），經LSD-t檢驗組間兩兩比較結果顯示，B組細胞IL-8 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達水平顯著高于A組，差異有統計學意義（P＜0.05）。B組細胞IL-8 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達水平高于D、E、F組，均差異有統計學意義（P＜0.05）。D、E、F組細胞IL-8 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達水平依次降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 RT-PCR檢測各組HBE細胞炎性因子mRNA表達水平/xˉ± s

3 討論

煙草煙霧中含有大量的自由基和其他多種有毒物質，對人體可造成多種危害，如細胞癌變、氣道損傷以及肺功能障礙等［12-13］。其中，長期吸煙病人慢阻肺的發病率明顯偏高，其主要發病機制為慢性氣道炎癥、上皮細胞氧化應激損傷。研究表明，中性粒細胞激活在吸煙引起的肺功能損傷過程中發揮關鍵性作用，其中IL-8、IL-6和TNF-α等炎性因子在中性粒細胞趨化過程中發揮重要作用［14-15］。在此背景下，本研究首先對健康人群及慢阻肺人群肺功能和外周血細胞炎性因子表達水平進行分析，進而通過以HBE細胞構建模型，探討抗炎藥地塞米松對香煙提取物誘導的HBE細胞炎性因子升高的影響，為臨床選擇合理的治療方式提供依據。

本研究結果表明慢阻肺病人外展血IL-8，IL-6及TNF-α水平均顯著高于對照組；慢阻肺病人外周血Klotho蛋白表達水平顯著低于對照組。上述結果說明慢阻肺病人外周血炎性因子含量顯著升高，這與相關研究［14-15］報道基本相符。此外，慢阻肺Klotho蛋白含量表達顯著降低，Klotho作為一種Ⅰ型跨膜蛋白，在腎臟、大腦組織分別較多，具有重要的生物功能。有研究表明Klotho基因發生突變的小鼠可表現出類似肺氣腫的多種癥狀，如出現肺泡壁斷裂、肺泡腔變大、呼吸時間變長等。因此，Klotho蛋白功能異常可能與肺氣腫形成，進而影響慢阻肺病情進展。

此外，體外實驗表明，B組細胞培養上清液IL-8、IL-6、TNF-α含量顯著高于A組，這一結果表明以香煙提取物作為體外刺激HBE細胞構建支氣管慢性炎癥的模型是成功的。B組細胞IL-8、IL-6、TNF-α含量高于D、E、F組。D、E、F組細胞IL-8、IL-6、TNF-α含量依次降低，差異有統計學意義。根據RT-qPCR結果，B組細胞IL-8、IL-6、TNF-α mRNA表達水平顯著高于A組。B組細胞IL-8、IL-6、TNF-α mRNA表達水平高于D、E、F組。D、E、F組細胞IL-8、IL-6、TNF-α mRNA表達水平依次降低。上述結果說明，地塞米松能夠下調香煙提取物引起的HBE細胞炎性因子分泌增加。其原因可能是地塞米松能夠減輕和避免組織對炎癥的過度反應，從而有助于減輕臨床多種炎癥表現。此外，作為一種激素類藥物，其能抑制包括巨噬細胞和白細胞等炎癥細胞在炎癥部位聚集，同時抑制吞噬作用、溶酶體酶的釋放，對多種炎癥化學中介物的合成和釋放均可產生影響［16-17］。從而有助于炎性因子水平的降低，緩解炎性癥狀。

綜合上述分析，可得出結論，香煙提取物體外刺激HBE細胞，可顯著降低Klotho因子含量，同時上調多種炎性因子基因的表達，體外給予地塞米松干預能夠降低HBE細胞炎癥反應。