強酸性電解質水對饑餓態糞腸球菌生物膜的殺滅作用研究

趙春苗，程小剛 ，余擎

根管治療術存在一定的失敗率，這些病例的失敗主要是由于根管內的細菌沒有被完全清除［1］。經過根管治療的患牙根管系統的內的營養物質大量減少，也就是說經過治療的根管為細菌提供的是一個營養缺乏的環境［2］，這時候細菌通過自身的適應性機制以饑餓的狀態來適應新的環境［3］。Stuart CH等［4-6］對根管治療后發生再感染的病例進行細菌培養發現，約24%～77%的根管中有糞腸球菌（enterococcus faecalis），它還可以長期饑餓生存并形成生物膜。

現有的應用最多的根管沖洗劑是不同濃度的次氯酸鈉（NaClO）。Liu H等［7］的研究發現次氯酸鈉對饑餓態的糞腸球菌生物膜有殺菌作用，所以本實驗選用次氯酸鈉作為陽性對照。PH值約為2.3～2.7的強酸性電解質水（strong acid electrolytic water，SAEW）［8-9］，由于它的安全性和抗菌效果較好，從二十幾年前便被嘗試用作根管沖洗劑［10］。Cheng X等［11］的實驗結果表明SAEW能殺滅糞腸球菌，但SAEW能否殺滅饑餓態糞腸球菌生物膜還需要研究。本實驗于2019年3—5月通過微生物學實驗觀察SAEW對饑餓態糞腸球菌生物膜的殺菌作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器糞腸球菌凍干株ATCC 29212（空軍軍醫大學口腔醫學院牙體實驗室）；腦心浸液培養基（BHI；Difco，MI，美國）；SAEW用專用的電解質水生成裝置-電解質水生成儀（Alfa Light；Amano Co.，日本）電解1 g/L的氯化鈉溶液陽極獲得；5.25%次氯酸鈉溶液（空軍軍醫大學口腔醫學院）；Biofuge Stratos型臺式冷凍離心機（Kendro，USA）；24孔板（NUNCLON；Nunc，Roskilde，Denmark）；干燥機（ES-2030，Hitachi，日本）；離子濺鍍系統（Lon Sputter E-1045，Hitachi，日本）；掃描電子顯微鏡（SEM，S-4800，Hitachi，日本）。

1.2 糞腸球菌饑餓狀態誘導及饑餓態糞腸球菌生物膜的形成參考Heim等［12］的方法，將糞腸球菌（ATCC 29212）凍干菌株復蘇后培養4 h，獲得對數生長期的糞腸球菌菌液，細菌密度約為1.5×109CFU/mL。在4℃條件下，低溫離心機以4 000 r/min的轉速離心15 min獲取糞腸球菌沉淀，把沉淀溶于磷酸緩沖鹽溶液（PBS）溶液中，再低溫離心并溶于PBS中，重復兩次后溶于PBS溶液中，調節細菌密度為109CFU/mL。調節好密度的細菌懸液置于37℃恒溫箱中在厭氧避光的條件下培養48 h，獲得饑餓態糞腸球菌。

將11×11 mm2蓋玻片（已高溫高壓滅菌器滅菌）置于24孔板中。滴1 mL饑餓態糞腸球菌菌液。37℃厭氧靜止培養24 h后饑餓態糞腸球菌生物膜形成。

1.3 不同沖洗劑對饑餓態糞腸球菌生物膜的殺菌作用觀察將饑餓態糞腸球菌生物膜分成9組，每組20個樣本，分別用5.25%次氯酸鈉、SAEW以及0.9%氯化鈉溶液（NS）處理1、5和10 min。處理后用PH＝7的PBS緩沖液輕柔地洗去殘留的處理液。每組中的10個樣本用震蕩的方法得到處理后的樣本，將菌液涂布于BHI平板，37℃厭氧培養24 h后，用活菌計數法得到被處理后細菌存活率。

每組中另10個樣本在4℃條件下用2.5%戊二醛隔夜固定。固定后用50%、70%、80%和90%的乙腈進行梯度脫水，每個濃度脫水20 min；接著100%的乙腈脫水2次，每次20 min。然后用干燥機二氧化碳臨界點干燥，干燥后用離子濺鍍系統噴金，噴金以后SEM觀察［13］。

1.4 統計學方法采用SPSS 13.0軟件（SPSS Inc.，Chicago，美國）對不同沖洗劑處理后細菌存活率xˉ±s進行方差分析。同一組別不同時間點比較以及同一時間點三組比較，用方差分析中的SNK-q檢驗進行兩兩比較，檢驗水準為α＝0.05。

2 結果

2.1 不同沖洗劑處理后活菌計數結果如表1所示，同一沖洗液1、5、10 min不同時間組之間進行組內比較發現SAEW和5.25%次氯酸鈉各時間組之間差異有統計學意義（P＜0.05），也就是說SAEW和5.25%次氯酸鈉對饑餓態糞腸球菌有殺滅作用，且處理1 min時的效果最弱，處理5 min時殺菌效果增強，處理10 min時的殺菌效果最強。同一時間不同沖洗液組間比較發現，SAEW和5.25%次氯酸鈉都有一定的殺菌作用，且殺滅效果都比NS組強（P＜0.05），同時5.25%次氯酸鈉處理1 min和5 min時對饑餓態糞腸球菌的殺滅作用比SAEW的作用強（P＜0.05）；但是處理10 min組時兩組的殺滅作用接近（P＞0.05）。說明SAEW對饑餓態糞腸球菌生物膜有有效的殺滅作用，且處理10 min的殺菌效果接近5.25%次氯酸鈉處理10 min的殺菌效果。

表1 不同沖洗液處理后的細菌存活率/（%，xˉ±s）

2.2 SEM觀察的結果SEM觀察結果顯示（圖1，2），饑餓態的糞腸球菌生物膜由皺縮失水的細菌細胞形成，細菌細胞表面凹凸不平、均一性較差。隨著NS處理時間的延長細菌細胞皺縮失水現象加重；SAEW和5.25%次氯酸鈉處理后不僅有嚴重的皺縮失水現象，還出現了細菌細胞的溶解和破壞、細胞膜表面有穿孔和碎片樣改變，而且隨著處理時間的延長細菌細胞的破壞更加嚴重。這提示SAEW和5.25%次氯酸鈉可能具備對饑餓態的糞腸球菌生物膜相似的殺滅機制。

圖1 未處理的饑餓態糞腸球菌生物膜掃描電子顯微鏡圖片（×50 000）

3 討論

根管治療術是臨床治療牙髓、根尖周病的常用手段［14］。Sun J等［15］的研究表明，在根管治療失敗的病例中糞腸球菌是主要的致病菌。經過嚴密的充填，根管內的營養物質匱乏、氧氣稀少，這時候根管內沒有被清理和殺滅的細菌微生物就會以饑餓的狀態生存［16-17］。糞腸球菌有一種長時間耐受饑餓的能力，只要環境中出現能被它利用的養分，它就可以很快吸收養分恢復活性并造成根管系統的再次感染［18］。

現代觀點認為，在根管治療過程中根管系統有沒有有效地清理是治療是否成功的重要步驟；通過機械預備清理根管內的感染物質、化學沖洗作用對根管進行清洗消毒，兩者結合以達到有效清理根管的目的［19］。現在常用的根管沖洗劑次氯酸鈉是應用的最多的沖洗劑［20］。Siqueira等［21］的研究表明，只要根管治療過程用次氯酸鈉進行根管沖洗，糞腸球菌的檢出率就顯會著降低。但是次氯酸鈉作為根管沖洗劑其殺菌的最佳濃度、溫度、作用時間等都不確定［20，22］。而且次氯酸鈉沖洗后牙本質的膠原纖維會被去除，從而降低牙本質的粘接性能［23］。此外，較高濃度的次氯酸鈉有一定的細胞毒性和刺激性作用，可能會造成根尖周組織的損傷［24-26］。次氯酸鈉還可能會引起病人的過敏反應［27］。所以次氯酸鈉雖然應用廣泛但并不是最理想的。Cheng X等［11］的實驗發現SAEW安全性好且對糞腸球菌（非饑餓態）有殺滅作用，本研究就在原有研究的基礎上研究SAEW對饑餓態糞腸球菌生物膜的殺菌作用。

本研究的活菌計數法實驗表明，SAEW對饑餓態糞腸球菌生物膜具有有效的殺滅作用，且作用10 min的殺菌效果和5.25%次氯酸鈉作用10 min的殺菌效果接近。SEM實驗表明，SAEW和5.25%次氯酸鈉處理饑餓態糞腸球菌生物膜后，細菌細胞皺縮失水現象加重，此外有的細胞發生溶解、破壞，細胞膜表面有穿孔和碎片樣改變，而且這種變化隨著處理時間地延長而更加明顯。研究表明，未解離的次氯酸是次氯酸鈉主要的殺菌成分［21］。次氯酸、氯氣、過氧化氫以及氫氧根離子的共同作用使SAEW有一定的殺菌作用［11］。相似的酸性成分使次氯酸鈉和SAEW處理后有相似的細菌形態的變化。

圖2 處理后的饑餓態糞腸球菌生物膜掃描電子顯微鏡圖片（×50 000）

綜上，SAEW對饑餓態糞腸球菌生物膜有有效的殺滅作用，且殺菌效果與5.25%次氯酸鈉的殺菌效果接近，殺菌機制也類似。聯合以往研究，SAEW對多種微生物有殺滅作用［28］。此外，SAEW在根管沖洗過程中還可以去除根管玷污層、對根尖周組織的細胞毒性低、使用后還原成水不會對環境造成污染等優點［28-30］。因此可以考慮用SAEW作為根管沖洗劑替代5.25%次氯酸鈉，但是目前還沒有實驗證明SAEW具有組織溶解性，所以SAEW作為根管沖洗劑還需要進一步的研究。