微RNA-27a介導3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗的作用機制

謝軍，韓造木，尹琬凌

微RNAs（miRNAs）在糖尿病及胰島素抵抗的發生過程中起重要作用，目前已發現多種miRNA通過各種作用方式導致或改善胰島素抵抗。作者前期研究發現miR-27a可以促進脂肪細胞胰島素抵抗［1］。本研究于2017年11月至2018年7月以腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導3T3-L1脂肪細胞的胰島素抵抗為模型，進一步研究miR-27a介導胰島素抵抗的作用機制及作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料3T3-L1前脂肪細胞購于中國科學院細胞庫，Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）高糖培養基購于美國Hyclone公司，胰蛋白酶購于bioswamp公司，胎牛血清（fetal bovine serum）購于美國Gibco公司，胰島素（Insulin），TNF-α，地塞米松（dexamethasone），異丁基甲基黃嘌呤（isobutyl methyl xanthine，IBMX）均購于美國sigma公司，脂質體2000（Lipofectamine 2000）購于美國Invitrogen公司，SYBR Green PCR試劑盒購于美國KAPA Biosystems公司，逆轉錄試劑盒購于日本TAKARA公司。miR-27a類似物（mimics）和miR-27a抑制物（inhibitor）購于廣州銳博生物科技有限公司。胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1），蘇氨酸蛋白激酶（Akt），糖原合成激酶（GSK-3β）等細胞信號通路蛋白及其磷酸化活性形式p-IRS1，p-Akt，p-GSK-3β抗體均購于英國Abcam公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 3T3-L1細胞胰島素抵抗模型的建立及miR-27a對葡萄糖攝取的影響3T3-L1前脂肪細胞在37℃，5%二氧化碳及飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清的DMEM培養基中恒溫培養、傳代。試驗時，將細胞接種于6孔板中，當匯合度達到70%時，用含誘導液（10 mg/L胰島素、1 μmol/L地塞米松和0.5 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤及10%胎牛血清）的DMEM培養基誘導分化48 h，撤掉地塞米松、IBMX，用含10 mg/L胰島素的DMEM培養基再培養48 h，然后換成含不含胰島素的10%胎牛血清的高糖DMEM培養基再繼續培養4 d，采用油紅O染色鑒定細胞的分化情況。向培養基中添加10 ng/L TNF-α繼續培養24 h，即可成功建立3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型。

細胞分為正常對照組，模型組，miR-27a mimics+模型組，miR-27a inhibitor+模型組。將3T3-L1細胞培養于24孔板中，實驗前1 d用含0.2%BSA的無血清培養基培養過夜。實驗前細胞在37℃含0.2%BSA的KRB緩沖液［含120.0 mmol/L氯化鈉（NaCl），6.0 mmol/L氯化鉀（KCl），12.5 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），1.2 mmol/L硫酸鎂（Mg-SO4），0.4 mmol/L磷酸二氫鈉（NaH2PO4），0.6 mmol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4），1.0 mmol/L氯化鈣（CaCl2）］中作用2 h，然后每孔加入含5微居里（μCi）脫氧3H葡萄糖的-脫氧葡萄糖混合液50 μL孵育5 min，然后吸去全部孵育液，冰磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細胞5次，干燥后室溫下每孔加入500 μL Triton-100裂解細胞30 min，最后取400 μL細胞裂解液于液閃計數器下檢測。

1.2.2 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測胰島素信號通路相關蛋白的表達變化 3T3-L1細胞分為正常對照組，模型組，miR-27a mimics+模型組，miR-27a inhibitor+模型組，分別以蛋白質印跡法檢測胰島素信號通路IRS1，Akt，GSK-3β的蛋白水平及蛋白磷酸化水平（活性形式）的變化。

1.2.3 實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（qPCR）檢測過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）的表達 分別收集各組的3T3-L1細胞，Trizol法提取總RNA，應用TAKARA逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，采用SYBR Green PCR試劑盒進行qPCR。反應體系按照說明書進行配置。采用GAPDH作為內參，根據qPCR反應曲線得到各組樣品目的基因和內參基因的Ct（Cycle threshold）值。首先計算△△C t值＝（實驗組目的基因的Ct平均值－實驗組內參基因的Ct平均值）－（對照組目的基因的Ct平均值－對照組目的內參基因的Ct平均值），則基因相對表達量為2-△△Ct。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因法檢測miR-27a的靶點 利用pmirGLO雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測miR-27a對PPARγ的直接調控作用。克隆PPARγ 3’非翻譯區（3’-UTR）區域，同時采用Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis kit試劑盒設計miR-27a結合位點突變區域（即陰性對照），插入pmirGLO載體中，擴增并抽提質粒。然后利用lipofectamine 2000與miR-27a mimics或inhibitor以及對照共轉染HEK293細胞。培養24 h后于熒光光度計下檢測熒光值以驗證miR-27a對PPARγ 3’-UTR的直接作用。

1.3 統計學方法所有結果利用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，所有數據采用xˉ±s表示，數據間比較采用單因素方差分析＋LSD法或成組t檢驗，P＜0.01表示數據間差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-27a對胰島素抵抗模型葡萄糖攝取的影響我們采用TNF-α法建立了3T3-L1胰島素抵抗的細胞模型，同時檢測了miR-27a對脂肪細胞胰島素抵抗模型中的葡萄糖攝取的影響。結果顯示：正常對照組，模型組，miR-27a mimics+模型組，miR-27a inhibitor+模型組四組的吸光度值分別為（2.03±0.20），（1.28 ± 0.27），（1.43 ± 0.20），（1.97 ± 0.18），模型組成功抑制了3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖的攝取，而miR-27a inhibitor則逆轉了模型組細胞對葡萄糖攝取的抑制。見圖1。

2.2 miR-27a對胰島素信號通路的影響胰島素和胰島素受體結合后會通過磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信號通路促進葡萄糖的攝取和轉運，從而降低血糖。因此我們檢測了miR-27a對PI3K/Akt信號通路相關蛋白的影響，結果顯示miR-27a mimics抑制了胰島素信號通路中IRS1、Akt、GSK-3β的磷酸化，而miR-27a inhibitor則恢復了模型組對IRS1、Akt、GSK-3β的磷酸化的抑制。見圖2。

圖1 miR-27a對葡萄糖攝取的影響（n＝3）

圖2 miR-27a對胰島素抵抗細胞模型信號通路的影響：A為正常對照組；B為模型組；C為模型組+miR-27a mimics；D為模型組+miR-27a inhibitor

2.3 qPCR驗證miR-27a對PPARγ的影響PPARγ在脂肪細胞分化及糖尿病的發病過程中起重要作用。有文獻報道miR-27a可以抑制PPARγ的表達，通過qPCR我們檢測了miR-27a對PPARγ表達的影響。結果顯示對照組和mir-27a組的相對值分別為（1.00±0.08）和（0.59±0.14），miR-27a可以顯著抑制PPARγ的表達。見圖3。

圖3 miR-27a mimics抑制PPARγ mRNA的表達（n＝3）

2.4 雙熒光素酶報告基因法驗證miR-27a的靶點 雙熒光素酶報告基因檢測法是驗證miRNA靶點的標準方法。本研究通過雙熒光素酶報告基因檢測法驗證PPARγ是否為miR-27a的靶點。結果顯示：miR-27a可以顯著抑制報告基因的表達，而miRNA的對照mir-NC及突變了結合位點的載體Mut均不能抑制報告基因的表達。結果證明PPARγ是miR-27a的靶點。PPARγ WT+miR-NC，PPARγ WT+miR-27a，PPARγ Mut+miR-NC，PPARγ Mut+miR-27a四組的熒光值分別為（5.37±0.80）、（3.17±0.57）、（4.94±0.63）、（4.68±0.74））。見圖4。

圖4 雙熒光素酶報告基因檢測法驗證miR-27a的靶點（n＝3）

3 討論

miRNAs是在一類長約20～24個核苷酸在進化上高度保守的非編碼RNA。miRNAs主要在轉錄水平上，通過與目標靶基因mRNA 3’-UTR結合，抑制目標靶基因的翻譯或者促進目標靶基因mRNA的降解，從而抑制目標靶基因的功能。到目前為止已發現多個miRNA通過各種不同的機制和途徑調節著糖尿病的發生和胰島素抵抗：如miR-29b可以通過調控PI3K通路抑制胰島素抵抗［2］。miRNA-93可以通過抑制葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporters 4，GLUT4）表達從而導致胰島素抵抗［3］，miRNA-145等通過p65轉錄因子途徑導致肝細胞胰島素抵抗等［4］。MiR-27a是一個調節脂肪細胞分化和成熟的miRNA［5］，大量研究表明 miR-27a在糖尿病病人及糖尿病動物模型中表達上調［6-11］，作者前期研究結果也表明miR-27a參與了脂肪細胞的胰島素抵抗，但是其作用機制卻并不清楚［1］。進一步了解miR-27a在糖尿病的發病機制及胰島素抵抗中的作用將為糖尿病的檢測和治療提供新的手段。

胰島素和胰島素受體結合后通過活化IRS1，激活PI3K/Akt信號通路，從而促進葡萄糖的攝取和利用。胰島素抵抗的產生主要是胰島素信號通路中的信號傳導受阻所致。我們檢測了miR-27a對胰島素信號通路的影響，結果顯示miR-27a抑制了胰島素信號通路中IRS1、Akt、GSK-3β的磷酸化，提示miR-27a通過抑制胰島素信號通路促進了胰島素抵抗。

然而，miR-27a的具體靶點并不清楚，生物信息學分析結果提示IRS1及GSK-3β的3’-UTR存在miR-27a的結合位點，提示IRS1及GSK-3β可能為miR-27a的靶標，但是我們蛋白質印跡法的結果以及雙熒光素酶報告基因的結果（結果未顯示）并未證明IRS1及GSK-3β是miR-27a的直接靶標。PPARγ是參與脂肪細胞生成、成熟、分化的一類核轉錄因子，主要表達于脂肪組織及免疫系統中。PPARγ在代謝性疾病，特別是糖尿病中起重要作用。PPARγ激動劑噻唑烷二酮類藥物已被用來治療糖尿病。已有研究表明miR-27a可以調節PPARγ的表達［12-14］，本研究則通過qPCR及雙熒光素酶報告基因檢測法進一步證實了PPARγ是miR-27a介導脂肪細胞胰島素抵抗的直接靶點。

由于一個miRNA可以有多個靶基因，一個靶基因也可以有多個miRNAs調節。為了了解miR-27a是否還有其它作用靶點，我們還對文獻［16-18］報道的miR-27a的靶基因同時也是調節胰島素信號通路的基因進行了檢測。叉頭框蛋白1（Forkhead box O1，FOXO1）是一類重要的轉錄因子，主要表達于胰島效應細胞，如脂肪細胞、肌肉細胞、肝細胞中。在胰腺中也僅表達于β細胞。FOXO1與糖脂代謝，胰島β細胞增殖與凋亡以及胰島素抵抗有密切關系［15］。有研究表明miR-27a可以通過靶向FOXO1從而調節細胞增殖與分化［16-18］。然而，在3T3-L1細胞中，我們并沒有觀察到miR-27a的對FOXO1靶向作用。同樣，有研究表明mir-27a可以靶向PI3K［19］，然而我們的實驗結果也并未顯示miR-27a直接調節PI3K的表達。是否還有其它的作用靶點，需要進一步研究證實。

綜上所述，在作者前期研究中發現miR-27a可介導3T3-L1脂肪細胞產生胰島素抵抗，然而機制并不十分清楚。在本研究中，進一步證實miR-27a可通過抑制胰島素信號通路、靶向PPARγ的表達進而介導胰島素抵抗。而miR-27a對PPARγ的下游信號通路的影響以及炎癥信號通路的影響將進一步明確miR-27a的作用機制。