益腎降糖膠囊水提液澄清工藝的優選

黃燕，潘旭東，林雄，單麗

益腎降糖飲是福建中醫藥大學附屬人民醫院的院內制劑（批準文號閩藥制字Z061060503），由制何首烏、赤芍、黃芩、玄參、地黃、黃芪等14味中藥組成，具有滋陰養血、益腎通絡之功效，用于糖尿病之腎虛氣弱、陰血虧損、脈絡瘀阻證。本品臨床使用二十幾年，經臨床驗證本方對于糖尿病腎病之蛋白尿，延緩糖尿病腎病的進展有較好的療效［1］。因益腎降糖飲為合劑，未經任何澄清工藝，久置易產生大量沉淀，外觀差，且藥品體積大不易攜帶，液體制劑穩定性較差，容易酸敗；故本試驗擬將其劑型改為膠囊劑。相比其他固體制劑，膠囊劑具有掩蓋藥物不良氣味和口味、服用方便、崩解快、溶出度高、吸收好、生物利用度高等優點，成為臨床常用的劑型之一［2］。因膠囊填充劑量有限，服用量不可過大，故需對提取液進行澄清處理，盡可能去除雜質，保留適量的浸膏，要求較低的浸膏得率。處方中何首烏、赤芍為主要成分，二者的主要活性成分為二苯乙烯苷和芍藥苷［3-5］，因此，本試驗于2018年4—6月以二苯乙烯苷、芍藥苷含量及干浸膏得率為澄清工藝優選的評價指標，比較殼聚糖澄清與醇沉的澄清效果，優選較佳的澄清工藝，為益腎降糖膠囊的工業化生產提供依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Ulit Mate-3000型高效液相色譜儀（戴安中國有限公司）；賽多利斯CPA-225D型電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；中佳SC-3614型低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；KQ-500DE型數控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海醫療器械五廠）；RW20.DZM.n型懸臂式攪拌機（廣州儀科實驗室技術有限公司），DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 試劑芍藥苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110736—200629）；2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110844—201512，含量以91.0%計）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。制何首烏、赤芍、黃芩、山藥等中藥飲片均購自福建承創堂有限公司，經該院副主任中藥師陳豪鑒定，均符合2015年版《中國藥典》一部各飲片項下的規定。

2 方法與結果

2.1 芍藥苷含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對照品適量，置25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1毫升含芍藥苷0.392 mg的對照品貯備液。精密吸取上述溶液3 mL置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成每1毫升含芍藥苷47.04 μg的溶液

2.1.2 供試品溶液的制備 精密吸取益腎降糖膠囊內容物制成的澄清液2 mL，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性供試品溶液的制備 精密吸取缺赤芍的供試品澄清液2 mL，置25 mL容量瓶，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得陰性供試品溶液。

2.1.4 色譜條件與系統適用性試驗［6-8］色譜柱：AccLaim 120 C18柱（4.6 mm×150 mm，5 m）；流動相：乙腈-水（19∶81）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。理論板數按芍藥苷峰計算應不低于3 000。分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液，按上述色譜條件進樣10 μL，記錄色譜圖，結果表明，在與對照品溶液色譜相應位置上，供試品溶液中芍藥苷與其它組分分離度良好，陰性供試品溶液無干擾，見圖1。

2.1.5 線性關系考察 取2.1.1項下配制的對照品貯備液，分別配制成濃度為31.36、47.04、62.72、78.40、94.08 μg/mL對照品溶液，按上述色譜條件，依次進樣，分別測定兩次，記錄芍藥苷的峰面積，以芍藥苷濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y?＝0.257 1X＋1.156 0（r＝0.999 6），表明芍藥苷在31.36～94.08 μg/mL范圍內與峰面積成良好的線性關系。

圖1 各種溶液的高效液相色譜圖：A為對照品；B為供試品；C為陰性供試品

2.1.6 精密度試驗 精密吸取2.1.1項下的對照品溶液，重復進樣6次，每次10 μL，記錄芍藥苷的峰面積，并計算相對標準偏差（RSD）為0.08%（n＝6），表明精密度良好。

2.1.7 重復性試驗 取同一批次樣品，平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測定芍藥苷峰面積，RSD為1.82%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.1.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h測定，記錄芍藥苷的峰面積，并計算其RSD值為1.33%（n＝6），表明供試品在12 h內基本穩定。

2.1.9 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的樣品溶液1 mL，平行操作6份，置25 mL容量瓶中，各精密加入已知含量的芍藥苷對照品貯備液2.5 mL，并用50%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得加樣回收率試驗供試品溶液，按2.1.4項下色譜條件進行測定，計算回收率，結果見表1。

2.2 二苯乙烯苷含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品適量，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品貯備溶液；精密吸取上述溶液1.0 mL置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成每1毫升含二苯乙烯苷17.654 μg的溶液。

表1 芍藥苷加樣回收率試驗結果（n＝6）

2.2.2 供試品溶液的制備 取2.1.2項下的供試品溶液。

2.2.3 陰性供試品溶液的制備 精密吸取缺制何首烏的供試品溶液按2.1.3項下方法制備，即得陰性供試品溶液。

2.2.4 色譜條件與系統適用性試驗［9-11］色譜柱：AccLaim 120 C18柱（4.6 mm×150 mm，5 m）；流動相：乙腈-水（23∶77）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：320 nm，進樣量：10 μL。理論板數按2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰計算應不低于2 000。分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液，按上述色譜條件進樣10 μL，記錄色譜圖，結果表明，在與對照品色譜相應位置上，供試品溶液中二苯乙烯苷與其它組分分離度良好，陰性供試品溶液無干擾，見圖2。

2.2.5 線性關系考察 取2.2.1項下配制的對照品貯備溶液，分別稀釋成濃度為3.530 8、7.061 6、8.827 0、17.654 0、26.475 0、44.135 0 μg/mL的對照品溶液，按2.2.4項下色譜條件，依次進樣，分別測定兩次，記錄二苯乙烯苷的峰面積，以二苯乙烯苷濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y?＝0.581 5X＋0.210 8（r＝0.999 6），表明二苯乙烯苷在3.530 8～44.135 0 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取2.2.1項下的對照品溶液，重復進樣6次，記錄二苯乙烯苷的峰面積，并計算其RSD為0.36%（n＝6），表明精密度良好。

2.2.7 重復性試驗 取同一批次樣品，平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測定二苯乙烯苷的峰面積，RSD為0.98%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.2.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h測定，記錄二苯乙烯苷峰面積，并計算其RSD為1.12%（n＝6），表明供試品在12 h內基本穩定。

圖2 各種溶液的高效液相色譜圖：A為對照品；B為供試品；C為陰性供試品

2.2.9 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的樣品溶液1 mL，平行操作6份，置25 mL容量瓶中，各精密加入已知含量的二苯乙烯苷對照品溶液10 mL，并用50%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得加樣回收率試驗供試品溶液，按2.2.4項下色譜條件進行測定，計算回收率，結果見表2。

表2 二苯乙烯苷加樣回收率試驗結果（n＝6）

2.3 益腎降糖膠囊提取液的制備按100 mL處方量稱取藥材，加8倍量的水，煎煮兩次，每次1 h，藥液過濾，合并濾液備用。

2.4 浸膏得率的測定取2.3項下的濾液，按以下各澄清工藝澄清藥液，取澄清液，置干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干后，置真空干燥箱60℃干燥至恒重，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速稱重。計算干浸膏得率（%）＝干浸膏質量/藥材質量×100%。

2.5 殼聚糖澄清工藝的優化

2.5.1 殼聚糖溶液的配制 稱取10 g殼聚糖，加1%醋酸溶液1 000 mL，攪拌，靜置使其充分溶脹，攪勻，即得1%殼聚糖溶液。

2.5.2 殼聚糖澄清水提液的制備 取2.3項下的濾液9份，分別將藥液濃縮為藥液比（藥材質量：藥液體積）1∶2、1∶4、1∶6的溶液各3份。

2.5.3 殼聚糖澄清工藝參數的篩選 參考相關文獻［12-14］，殼聚糖的澄清效果主要與藥液比、殼聚糖加入量（每1克藥材所需殼聚糖溶液的體積）、絮凝溫度、攪拌時間、藥液PH、攪拌速率、靜置時間等因素有關，根據預試驗結果，篩選A藥液比、B殼聚糖加入量、C絮凝溫度、D攪拌時間進行優化，選擇L9（34）正交表設計試驗，對2.5.2項下的9份提取液，按表3設計進行澄清工藝處理，將9份絮凝液室溫靜置24 h，離心（轉速4 000 r/min，時間30 min），取上清液，將藥液濃縮至100 mL，備用。以澄清液中芍藥苷、二苯乙烯苷含量和浸膏得率為評價指標，采用綜合加權評分法進行數據處理，三項指標權重系數分別為0.4、0.4、0.2；綜合評分＝芍藥苷含量/芍藥苷含量最大值×100×0.4＋二苯乙烯苷含量/二苯乙烯苷含量最大值×100×0.4＋最小浸膏得率/浸膏得率×100×0.2；滿分為100分，綜合評分值越大，表示澄清效果越好。試驗安排及結果見表4，5。

2.5.4 統計學方法本試驗正交設計選用L9（34）表頭，采用正交助手ⅡV3.1分析軟件進行數據分析，檢驗水準取α＝0.05。

表3 澄清工藝正交試驗因素水平表

表5 綜合評分方差分析結果

2.5.5 殼聚糖澄清工藝結果分析 本正交試驗以芍藥苷、二苯乙烯苷、浸膏得率為指標，進行綜合評分。由各因素直觀分析的K值高低可以得出影響絮凝效果的因素主次順序為A＞C＞D＞B，即藥液比＞絮凝溫度＞攪拌時間＞殼聚糖加入量，最佳絮凝工藝組合為A1B1C3D3。以極差值最小的B因素為誤差項進行方差分析，結果表明攪拌時間差異無統計學意義（P＞0.05），藥液比、絮凝溫度對殼聚糖絮凝純化工藝的影響均差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）［15］。

2.5.6 殼聚糖澄清工藝驗證試驗 按處方比例稱取200 mL處方量藥材，按2.3項下方法制得水提液，平行操作3份，按照最佳殼聚糖澄清工藝進行3次重復驗證試驗，測定芍藥苷、二苯乙烯苷的含量及浸膏得率，結果分別為1.113 mg/mL、0.207 2 mg/mL、17.65%（RSD分別為0.59%、1.42%、1.82%，n＝3），說明該工藝穩定可行。

表4 正交試驗設計L9（34）與結果考察

2.6 醇沉工藝乙醇沉淀法能去除藥液中的淀粉、樹膠等多糖類和蛋白質等雜質，影響醇沉效果的主要因素有藥液濃縮比（藥材質量∶藥液體積）和藥液含醇量，故采用單因素試驗對這兩個因素進行考察［16-17］。

2.6.1 藥液濃縮比的考察 取2.3項下的濾液3份，將藥液分別濃縮至2∶1、1∶1、1∶2，加入95%乙醇，邊加邊攪拌，使藥液含醇量為70%，藥液靜置24 h，離心（轉速4 000 r/min，時間30 min），取上清液，將藥液濃縮至100 mL。按2.1、2.2、2.4項下方法分別測定澄清液中芍藥苷、二苯乙烯苷含量及浸膏得率，按2.5.3項下方法進行綜合評分，結果見表6。

表6 藥液濃縮比考察結果

表6結果表明：藥液濃縮比為1∶2時，綜合評分最高，因此選擇藥液濃縮比1∶2。

2.6.2 藥液含醇量的考察 取2.3項下的濾液7份，將藥液濃縮為1∶2，分別加入95%乙醇，邊加邊攪拌，使含醇量分別為50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%，藥液靜置24 h，離心（轉速4 000 r/min，時間30 min），取上清液，將藥液濃縮至100 mL。按2.1、2.2、2.4項下方法分別測定澄清液中芍藥苷、二苯乙烯苷含量及浸膏得率，按2.5.3項下方法進行綜合評分，結果見表7。

表7 藥液含醇量考察結果

表7結果表明：含醇量為70%時，綜合評分最高，因此選擇藥液含醇量為70%。

2.6.3 醇沉工藝驗證試驗 按處方比例稱取200 mL處方量藥材，按2.3項下方法制得水提液，平行操作3份，將藥液濃縮為1∶2，加入95%乙醇，邊加邊攪拌，使含醇量為70%，藥液靜置24 h，離心（轉速4 000 r/min，時間30 min），取上清液，將上清液濃縮至200 mL，備用。測定芍藥苷、二苯乙烯苷的含量及浸膏得率，結果分別為0.980 6 mg/mL、0.207 9 mg/mL、15.24%（RSD分別為0.78%、1.28%、1.22%，n＝3），說明該工藝穩定可行。

2.7 最佳澄清工藝的確定將2.5.4與2.6.3項下兩種工藝驗證結果進行比較，殼聚糖澄清處理的樣品芍藥苷含量比醇沉工藝高13.5%，二苯乙烯苷的含量差別不大，但浸膏得率也高15.4%。殼聚糖澄清工藝不利于填充，可在后續成型工藝中優化，但在大規模生產中，若采取醇沉工藝，生產車間需要防爆設計，建造成本高，安全性能要求高。綜合考慮生產成本、生產安全性，采用殼聚糖澄清工藝，具有更明顯的優勢，更適合醫院制劑的發展，故最終確定益腎降糖膠囊水提液的澄清工藝采用殼聚糖絮凝澄清法，即藥液濃縮比1∶2，在60℃絮凝溫度，每1克藥材殼聚糖加入量為0.4 mL，攪拌時間20 min。

根據最佳澄清工藝，100 mL澄清液可約得9 g干浸膏，初步設想浸膏∶輔料的比例為3∶1，采用95%乙醇制軟材，過二號篩制粒，四號篩整粒，選擇零號膠囊，每粒裝0.5 g，可得24粒膠囊。后續具體工藝將在益腎降糖膠囊成型工藝研究中繼續探討。

3 討論

本研究含量測定選擇的指標為芍藥苷、二苯乙烯苷，用于優化益腎降糖膠囊水提液的澄清工藝。益腎降糖膠囊由14味中藥組成，成分復雜，芍藥苷、二苯乙烯苷只是其眾多有效物質的其中2種，以兩種成分反映整個復方制劑的情況有一定的片面性。后續會在指標成分的選擇上做進一步的研究，希望能更客觀地反映整個復方制劑的情況。