限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應法檢測人細胞色素氧化酶2D6藥物代謝相關基因位點多態性

夏清榮，單鋒，徐亞運，梁俊，曹銀，柳楊，閆春宇

人細胞色素氧化酶2D6（Cytochrome P450 2D6，CYP2D6）作為細胞色素P450酶家族（CYP450）重要的一員，約25%經CYP450酶系代謝的藥物受其影響，CYP2D6參與眾多藥物的體內代謝過程，主要包括抗抑郁藥、抗精神病藥和阿片類藥物等［1-2］。相關研究表明，CYP2D6?2、CYP2D6?10和CYP2D6?14基因多態性對CYP2D6酶的活性及藥物代謝具有重要的影響［3-5］。限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）是一種經典的基因型檢測方法，具有分型技術簡單，結果穩定，特異性好，靈敏度高，對檢材質量要求低等優點［6-7］，因此，本實驗旨在通過PCR-RFLP法建立一種簡便、準確和經濟的CYP2D6基因型檢測方法，為臨床個體化用藥提供遺傳學的依據。

本研究起止時間為2017年8月至2018年6月。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 HC-2518型高速離心機（安徽中科中佳公司），C1000TMThermal型實時定量熒光PCR儀（美國BIO-RAD公司），DYY-6C型電泳儀（北京六一公司），GenoSens-1850型凝膠成像儀（上海勤翔公司）。

1.1.2 試劑 （1）DNA提取試劑盒：血液DNA小量提取試劑盒（HiPure Blood DNA Mini kit），型號D3111-03，Magen公司；（2）聚合酶鏈式反應混合物（PCR Mix）：貨號P2012，廣州東盛生物科技有限公司；（3）DNA凝膠加樣緩沖液（DNA loading buffer 5）：上海遠慕公司；（4）無水乙醇：江蘇強盛公司；（5）瓊脂糖：德國biofroxx公司；（6）引物：通用生物公司；（7）HphI限制性內切酶：型號ER1101，Thermo scientific公司；（8）HhaI限制性內切酶：型號 ER1851，Thermo scientific公司；（9）MspI限制性內切酶：型號ER0541，Thermo scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和處理 抽取靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸·鉀離子（EDTA·K+）抗凝管中，4℃保存，長期-80℃保存。

1.2.2 DNA的提取和PCR擴增 外周血總DNA提取采用Magen公司血液DNA小量提取試劑盒，按照說明書操作。PCR擴增采用普通PCR的方法，按照說明書操作，實驗中所涉及到的引物序列見表1。

表1 PCR使用的引物

PCR擴增反應體系：DNA模板5.0 μL，正向引物1.0 μL，反向引物1.0 μL，雙蒸水（ddH2O）18.0 μL，PCR Mix 25.0 μL。PCR反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，40個循環，4℃保存，待酶切。

1.2.3 限制性內切酶處理PCR擴增產物 取4 μL PCR擴增產物采用1.5%凝膠進行凝膠電泳（80 V條件下30 min），凝膠成像儀下觀察PCR擴增結果，確保DNA擴增產物量達到酶切的條件。將擴增產物進行酶切，37℃水浴16 h，酶切反應體系：PCR擴增產物8.0 μL，限制性內切酶0.5 μL，10×New England Biolabs公司酶緩沖液（NE Buffer）2.0 μL，雙蒸水（ddH2O）9.5 μL。

不同CYP2D6基因型對應的限制性內切酶見表2。

表2 限制性內切酶的種類

1.2.4 酶切結果 取8 μL酶切產物用2%凝膠進行凝膠電泳（80 V條件下15 min，然后120 V條件下15 min），凝膠成像儀下觀察酶切結果。

2 結果

2.1 CYP2D6?2 PCR-RFLP結果樣本PCR擴增產物長度為211 bp的特異性片段。CYP2D6?2野生型純合子CC產生128 bp+83 bp的片段，突變型純合子TT產生211 bp的片段，突變型雜合子CT產生211 bp+128 bp+83 bp的片段。PCR擴增產物及經HhaI酶切后所得產物結果見圖1。

圖1 CYP2D6?2擴增產物的酶切結果分析

2.2 CYP2D6?10 PCR-RFLP結果樣本PCR擴增產物長度為272 bp的特異性片段。CYP2D6?10野生型純合子CC產生213 bp+59 bp的片段，突變型純合子TT產生112 bp+101 bp+59 bp的片段，突變型雜合子CT產生213 bp+112 bp+101 bp+59 bp的片段。PCR擴增產物及經HphI酶切后所得產物結果見圖2。

圖2 CYP2D6?10擴增產物的酶切結果分析

2.3 CYP2D6?14 PCR-RFLP結果樣本PCR擴增產物長度為492 bp的特異性片段。CYP2D6?14野生型純合子CC產生285bp+207bp的片段，突變型純合子TT產生492bp的片段，突變型雜合子CT產生492bp+285bp+207bp的片段。PCR擴增產物及經MspI酶切后所得產物結果見圖3。

圖3 CYP2D6*14擴增產物的酶切結果分析

3 討論

藥物代謝主要依賴于肝微粒體中的各種酶系，其中最重要的是CYP450酶系。CYP2D6作為CYP450家族重要的一員，主要參與抗精神病藥物、抗抑郁藥物和抗心律失常藥物等的體內代謝過程［8］。目前已經發現CYP2D6存在100個以上的等位基因［9］，這些基因突變后往往引起酶活性和數量的改變［10］，進而影響藥物在體內的代謝速率，最終影響藥物的療效和導致不良反應的發生。

研究表明，CYP2D6基因多態性與抗高血壓藥物療效及不良反應發生率存在一定的相關性［11-14］。Yoshihiro等［11］對1 880例研究對象的非同質單核苷酸多態性進行了分析，結果發現CYP2D6?10功能突變位點發生頻率最高，達到51%～70%，而CYP2D6?10位點的突變可降低酶的活性，對美托洛爾藥代動力學的影響甚為明顯［12］。桑海強等［13］的研究證實了這一觀點，依據基因型確定給藥方案的治療組降壓總有效率顯著高于常規治療組，同時不良反應發生率明顯降低。目前，臨床已推薦口服美托洛爾前檢測CYP2D6基因型，根據基因型調整給藥劑量，以保證病人獲得最大收益的同時降低發生不良反應的風險［14］。CYP2D6在某些常用的精神科藥物代謝過程中亦扮演了重要角色。國內外研究結果顯示，利培酮、奮乃靜、阿立哌唑、氯丙嗪等抗精神病藥物的代謝過程與CYP2D6基因多態性密切相關［15-17］，其中CYP2D6?2、?10、?14基因型對抗精神病藥物體內代謝過程影響重大［3-5］，可影響血藥濃度、療效及不良反應的發生，而精神科藥物往往不良反應多且相對較為嚴重，因此，開展CYP2D6基因多態性的臨床檢測意義重大。

目前，在研究和檢測藥物基因組學方面，主要技術方法包括PCR-DNA測序技術、基因芯片技術、順序特異性寡核苷酸聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide，PCRSSO）技術及等位基因特異性寡核苷酸探針（polymerase chain reaction-allele specific oligonucleotide，PCR-ASO）技術等，這些技術方法的特點為自動化程度較高，人為操作影響小，但以上技術方法存在檢測成本高、實驗室條件要求嚴苛和操作復雜等缺點。因此，我們希望建立一種簡便、快速、準確、經濟的等位基因檢測方法，用于鑒別CYP2D6的基因型，為臨床個體化用藥提供遺傳學依據。

PCR-RFLP是一種經典的基因多態性檢測方法，技術方法成熟，具有操作簡單、特異性高、重復性好等優點，相對之前所述技術方法而言，儀器設備、實驗條件等投入成本較低，較為適合條件一般的實驗室應用，可被廣泛使用于醫療機構的臨床檢驗。為此，我們查閱了相關文獻，發現有研究者曾采用PCR-RFLP法檢測CYP2D6位點的基因多態性。由于CYP2D6在外周血中表達量不及肝臟細胞，故與文獻［17］中所采用的方法相比較，本實驗通過增加PCR擴增體系中DNA模板上樣體積確保擴增效果，同時，本研究降低了引物濃度以減少PCR擴增過程中引物二聚體對結果的影響。另外，我們通過降低退火溫度和增加循環數確保模板DNA得到有效擴增的同時避免了雜帶擴增帶來的不利影響。通過以上的優化和改進，使得模板DNA得到有效的擴增，電泳條帶清晰明了，避免了二聚體和雜帶擴增帶來的影響。

我們的實驗方法亦具有經濟節約、降低實驗成本的優點，相較于采用PCR-DNA測序技術、基因芯片技術等高新技術所需配備的諸如焦磷酸測序儀、基因芯片測序儀等上百萬甚至數百萬的昂貴設備，PCR-RFLP法僅需配備數千元的設備即可；同時由于限制性內切酶價格較高，在保證酶切結果穩定、可靠、滿意的前提下，與文獻［17］相比較，本實驗酶切體系限制性內切酶的用量減半，有效地降低了實驗成本。另外，本研究的結果采用焦磷酸測序法進行了驗證（由安徽通用生物系統有限公司完成，測序號為s142585、s143294和s155376），進一步證實了PCR-RFLP法的可靠性。然而，PCR-RFLP法亦有其明顯的缺點，主要是通量太低，大量分型時工作量大，并且只適用于部分單核苷酸多態性分型。值得注意的是，采用PCR-RFLP法檢測基因多態性時，需盡可能確保模板DNA擴增的特異性，避免非特異性產物的出現從而競爭酶活性，導致模板DNA剪切不完全及雜帶的出現；同時，酶切過程需盡可能充分、完全，避免假陰性結果的出現。

綜上所述，本研究建立了以PCR-RFLP法為基礎的CYP2D6藥物代謝相關基因位點基因型檢測的方法，該方法具有簡便、高效、準確、經濟的特點，可在臨床及實驗室推廣使用，以期為臨床個體化合理用藥和精準醫療及相關基礎研究提供方法依據。