3-巰基丙酮酸硫轉移酶產生的硫化氫在大鼠腦血管張力和腦血管內皮細胞缺氧損傷中的作用

李夢，李亞男，劉欣，王香溢，郭巖，陳志武

缺血性腦血管疾病是一種普遍的臨床疾病，而且，目前對于全球，都是一個重要的公共衛生問題，可是它發病的病理、生理機制還不是很清楚。因此，對于醫學界，如果能夠明確缺血性腦損傷的機制是非常有價值的［1］。內源性硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是由血管內皮細胞產生和釋放，并且參與腦血管疾病的過程。內源性硫化氫主要由胱硫醚-β-合成酶（l-cystathionine-β-synthetase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（L-cystathionine-γ-lyase，CSE）催化半胱氨酸（l-cysteine，L-Cys）生成［2］。線粒體酶3-巰基丙酮酸硫轉移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST）是在各種細胞和組織中新發現的內源性硫化氫來源之一［3］。據報道，3-MST主要存在于線粒體中，可催化線粒體中硫化氫的生成［4］，有研究表明外源性硫化氫供體硫氫化鈉對線粒體有明顯的保護作用，可減少線粒體的損傷［5］。還有研究表明低濃度的硫化氫以及內源性線粒體內產生的硫化氫有利于哺乳動物細胞中線粒體電子運輸和ATP生成［6］。因此，硫化氫可能也是保護線粒體免于損傷的一個重要的因素。鑒于硫化氫是參與缺血性腦損傷的重要因子，而目前文獻資料對細胞質中CSE或CBS產生的硫化氫研究較多，但對線粒體中3-MST生成的硫化氫研究較少，而后者也有大量的硫化氫生成，因此本研究于2017年10月至2018年12月探討內源性硫化氫來源之一——3-MST產生的硫化氫對血管張力的影響以及對缺氧損傷的血管內皮細胞是否具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料血栓素A2受體激動劑U46619（美國Sigma公司，批號0481065）；硫基丙酮酸二水合物（3-mercaptopyruvate，3MP）（美國Sigma公司，批號90374）；天門冬氨酸（L-aspartic acid，ASP）（北京Solarbio公司，批號506B041）；5-氨基-3-（4-嗎啉基）-1，2，3-惡二唑鎓鹽酸鹽（SIN-1）（阿拉丁，批號C1828094）；乙酰膽堿（acetylcholine）（源葉生物公司，批號M20A9K68269）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）（西隴化工廠）；H2DCFH-DA檢測試劑盒（碧云天公司）；Krebs Henseleit緩沖液（分別含氯化鈉119 mmol/L，氯化鈣2.5 mmol/L，氯化鉀4.7 mmol/L，碳酸氫鈉15 mmol/L，硫酸鎂1.17 mmol/L，磷酸二氫鉀1.18 mmol/L，葡萄糖5.5 mmol/L，調節PH至7.4）。

1.2 方法

1.2.1 血管環的制備和內皮完整性的檢測［7］SD大鼠60只，雌雄各半，7～8周齡，200～220 g，購于安徽醫科大學實驗動物中心，醫學實驗動物合格證號與使用許可證號均為SCXK（皖）2017-001。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。稱重，記錄水合氯醛劑量（10%，0.3 mL/100 g）；腹腔注射，麻醉；麻醉后，取腦，放置于4℃的Krebs Henseleit緩沖液中，該液通入95%氧氣和5%二氧化碳；顯微鏡下，分離基底動脈，再制成3 mm的血管環，并且把血管固定在張力傳感器的浴槽內；浴槽中有盛有5 mL Krebs Henseleit緩沖液（PH為7.4），37℃恒溫并且持續不斷的通入95%氧氣和5%二氧化碳的混合氣體。張力儀調零平衡后，再次調整，給予血管環預負荷張力2 mN，待血管穩定，用100 nmol/L的U46619收縮血管環10 min，再用10 nmol/L乙酰膽堿舒張血管，檢測內皮完整。如果血管舒張率高于80%，那么，認為內皮完整；如果血管舒張率低于20%，即認為去除內皮。

1.2.2 觀察3-MST底物3MP和抑制劑ASP對U46619預收縮的血管環的影響 將內皮完整的SD大鼠腦基底動脈血管按隨機數字表法分為：Krebs Henseleit緩沖液對照組、3MP組、ASP組、SIN-1組、ASP＋SIN-1組及3MP＋SIN-1組，共6組。血管平衡后，用10-7mol/L U46619收縮血管穩定后，觀察3MP和ASP在1×10-5.5～1×10-3mol/L范圍內和SIN-1在1×10-7～1×10-3.5mol/L范圍內對血管的舒張作用。以加入1×10-7mol/L U46619誘發的收縮張力為100%，按照下列各式計算ASP等的血管舒張百分率。舒張百分率＝（U46619誘導的收縮張力－加ASP等后收縮張力）/U46619誘導的收縮張力×100%。再制備一批去內皮血管環，檢測SIN-1對U46619預收縮的去內皮血管環的影響。

1.2.3 血管內腔灌注液中硫化氫含量的測定 各組血管實驗結束，收集灌注液。取0.1 mL灌注液，根據試劑盒說明操作，按順序加入各個試劑（蒸餾水、醋酸鋅、硫酸鐵銨等），室溫靜置20 min后，波長調為665 nm，用紫外分光光度計檢測，記錄各組的吸光度值（A665）。用硫氫化鈉制備硫化氫標準曲線，計算各組硫化氫的含量。

1.2.4 原代培養大鼠腦血管內皮細胞 取大鼠6只，麻醉，用75%乙醇消毒2 min。將大鼠放在無菌操作臺上，注射用0.9%氯化鈉溶液進行心臟灌流，無菌狀態下斷頭取腦，置于顯微鏡下小心剝離腦血管，用無菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）涮洗2遍，將血管轉移至預先加有膠原酶Ⅱ（工作濃度為2 mg/mL）的EP管中，用眼科剪將腦血管反復剪碎后，37℃消化30 min，消化后離心，保留沉淀。給予培養液培養；1～3 h后換液，目的是把懸浮的細胞和組織碎塊去除，之后根據細胞狀態，3～5 d再次換液。等到80%細胞融合，傳代，進行實驗。

1.2.5 實驗分組以及內皮細胞缺氧損傷模型的建立 將鋪滿單層且生長狀態良好的內皮細胞按隨機數字表法分為6組，對照組，模型組，3MP組，ASP組，SIN-1組，3MP＋SIN-1組；除對照組以外，其他5組進行缺氧處理，即將細胞置于37℃，95%氮氣、5%二氧化碳的厭氧室中，厭氧室中的氧氣濃度用氧傳感器監測且維持在低于1%，急性缺氧4 h。

1.2.6 ASP、3MP及SIN-1對內皮細胞活力的影響按照“1.2.5”分組，檢測細胞生存率。缺氧4 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），于37 ℃，5%二氧化碳避光孵育4 h，吸棄上清液，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），震搖10 min。于490 nm波長，用酶標儀檢測吸光度，重復3次。

1.2.7 3-MST活性對內皮細胞培養上清中乳酸脫氫酶（LDH）的影響 將細胞按照“1.2.5”分組，缺氧后，收集培養液上清，測定LDH水平。LDH含量用二硝基苯肼法測定，反應完成后，溶液顯紅棕色，按照朗伯比爾定律（Lambert-Beer law），可比色得到酶活力。

1.2.8 3-MST對內皮細胞活性氧的影響 采用H2DCFH-DA熒光探針，檢測細胞內活性氧，細胞種板后，細胞生長至70%時用無血清的DMEM饑餓24 h，處于同一生長周期后，按照“1.2.5”分組給藥，缺氧4 h，加入H2DCFH-DA熒光探針后，37℃避光孵育30 min后，熒光顯微鏡下觀察細胞內活性氧情況。

1.3 統計學方法 采用Graphpad 6軟件對實驗數據進行分析，所有數據均以xˉ±s表示。兩組間比較采用成組t檢驗；多組之間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較用SNK法。P＜0.05時，認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ASP、3MP對U46619預收縮的血管環的影響如表1所示，與對照組相比，3-MST抑制劑ASP對U46619預收縮的血管環差異無統計學意義（P＞0.05）；3-MST底物3MP（1×10-5.5～1×10-3mol/L）可使U46619預收縮的血管環舒張，最大效應（Emax）為（25.36±0.81）%。與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 梯度濃度的ASP、3MP對血管張力的影響（n＝6）

2.2 SIN-1對U46619預收縮內皮完整和去內皮血管環的影響如表2所示，3-MST激動劑SIN-1（1×10-4.5～1×10-3.5mol/L）能夠舒張大鼠腦基底動脈環（P＜0.05），并且具有濃度依賴性，其引起50%最大效應濃度（EC50）為（10-4.63±100.058）mol/L，Emax為（94.67±3.99）%；與內皮完整動脈環（+Endo）相比，SIN-1在1×10-4.5，1×10-4mol/L濃度下，去內皮動脈環（-Endo）對SIN-1的敏感度降低，但與對照組比較依然差異有統計學意義（P＜0.05），EC50為（10-4.073±100.059）mol/L，Emax為（102.50±5.51）%，甚至超過在內皮完整動脈環上的Emax。

表2 梯度濃度的SIN-1對內皮完整/去內皮血管環的影響（n＝6）

2.3 ASP、3MP對SIN-1舒張血管的影響如表3所示，SIN-1的 EC50為（10-4.63± 100.058）mol/L，Emax為（99.49±6.46）%。與單用SIN-1組比較，ASP+SIN-1組能夠減弱SIN-1舒張血管作用，EC50升高至（10-3.886±100.622）mol/L，Emax為（95.56±9.62）%，差異有統計學意義（P＜0.05）；而3MP+SIN-1組能夠增強SIN-1舒張血管的作用，EC50降至（10-5.586±100.1003）mol/L，Emax為（111.49±9.62）%，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 ASP、3MP對SIN-1舒張血管的影響（n＝6）

2.4 3MP、SIN-1及ASP等對血管內腔灌注液中硫化氫含量的影響結果如圖1，大鼠基底動脈在用U46619收縮后（對照組）就有（40.87±4.83）μmol硫化氫的產生，與對照組比較，3MP（1×10-5mol/L）組硫化氫的含量（51.19±2.45）μmol增加，差異有統計學意義（P＜0.01），SIN-1（1×10-3.5mol/L）組硫化氫的含量（80.39±3.09）μmol增加（P＜0.01），而單獨用ASP（1×10-3mol/L）組硫化氫的含量（36.77±1.88）μmol沒有影響（P＞0.05）。與單用SIN-1組比較，ASP＋SIN-1組硫化氫含量（69.25±2.26）μmol降低（P＜0.01），3MP＋SIN-1組硫化氫含量（90.09±5.36）μmol升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.5 3MP、SIN-1及ASP對內皮細胞活力的影響結果如圖2所示，與對照組比較，模型組MTT染色可見細胞活力（56.75±1.59）%降低（P＜0.01）。與模型組相比，3MP組細胞活力（66.05±3.07）%增加，差異有統計學意義（P＜0.05），SIN-1組細胞的活力（66.89±4.46）%也增加（P＜0.05），3MP＋SIN-1組更加提高了細胞活力（75.41±6.81）%，差異有統計學意義（P＜0.05），而ASP組細胞活力（48.40±3.13）%下降（P＜0.05）。

2.6 3MP、SIN-1及ASP對內皮細胞培養上清液中LDH的影響如表4所示，與對照組比較，模型組培養液中LDH升高（P＜0.01），表明缺氧所致血管內皮細胞損傷引起LDH漏出增多；與模型組相比，單獨使用3MP和SIN-1，能使內皮細胞上清液中LDH下降（P＜0.01）；3MP＋SIN-1組，LDH水平下降（P＜0.01）；使用ASP，上清液中LDH有所升高（P＜0.01）。

圖1 ASP、3MP及SIN-1對灌注液中硫化氫含量的影響

圖2 MP、SIN-1及ASP對內皮細胞活力的影響

表4 各組細胞培養液中LDH含量比較

圖3 3MP、SIN-1及ASP對細胞內活性氧的影響（H2DCFH-DA熒光探針×200）（n＝3）：A為對照組，B為模型組，C為3MP組，D為ASP組，E為SIN-1組，F為3MP+SIN-1組，G為量化圖

2.7 3MP、SIN-1及ASP對細胞內活性氧含量的影響如圖3所示，與對照組相比，模型組活性氧水平（487.5±19.48）%明顯升高（F＝21.54，P＜0.01）；與模型組比較，SIN-1組活性氧水平（310.18±42.80）%降低（P＜0.05），3MP＋SIN-1組活性氧水平（300.18±40.01）%降低（P＜0.05）；但是 3MP組（390.30±92.72）%和ASP組（520.87±14.82）%對活性氧水平影響小，差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

腦血管疾病是致死的重要原因之一［7］。對于腦缺血疾病，腦血管的自我調節對于保護大腦是具有重要意義的［8］。有研究表明，外源性新型硫化氫供體GYY4137能夠減輕大鼠腎缺血損傷［9］。近年來，證實了硫化氫是一種重要的內源性的氣體［9］，并具有廣泛的生理功能，如硫化氫參與調解血管舒張與收縮［10-12］、細胞的增殖和凋亡、腦保護等［13］。而在冠狀動脈中，3-MST依賴3-MP產生內源性的硫化氫，進一步支持了3-MST是硫化氫的重要來源的觀點［14］。而且，據報道，3-MST在血管內皮細胞［15］，星形膠質細胞［16］和神經元［17］等都有表達。

在此基礎上，本研究通過運用3-MST的抑制劑ASP，底物3MP和激動劑SIN-1探討3-MST生成的硫化氫對血管舒張是否有作用以及能否保護腦血管內皮細胞，結果提示對于血管舒縮來說，3-MST底物3MP能夠促進血管舒張，3-MST激動劑SIN-1對大鼠基底動脈有濃度依賴性的舒張作用，而ASP雖然有引起血管收縮的趨向，可是差異無統計學意義；ASP能夠減弱SIN-1舒血管作用，3MP能夠增強SIN-1舒血管作用。血管環灌注液中硫化氫含量同樣表明，3MP和SIN-1能夠增加硫化氫的生成量，并且3MP和SIN-1有協同作用，而ASP能夠抑制SIN-1的作用，這與上述血管舒張作用的結果是一致的，進一步說明了3-MST生成的硫化氫參與了舒張腦基底動脈血管作用。

本研究進一步發現，SIN-1對內皮完整血管的舒張效應勝過去內皮血管，提示3-MST產生的硫化氫介導的舒血管作用有內皮依賴性機制的參與，也就是說，內皮細胞可以通過3-MST來產生釋放硫化氫，舒張大鼠腦血管。因此，我們檢測了3-MST的活性對內皮細胞的影響。內皮細胞缺氧損傷后，通過測定細胞活性、LDH漏出和活性氧的含量來反應細胞損傷程度。結果提示，3-MST的活性能夠明顯影響到內皮細胞的活力，加入ASP能夠降低細胞活力，而使用3MP，SIN-1能夠增加細胞活力，減少LDH漏出，減少細胞中活性氧的水平，保護線粒體。結果表明，3-MST產生的硫化氫對于缺氧的內皮細胞具有保護作用。

綜上所述，3-MST可催化硫化氫的生成，對腦基底動脈有舒張作用而且能夠保護缺氧損傷的腦血管內皮細胞。