改良法體外分離培養炎癥來源的人牙周膜干細胞

劉 焱 陳青宇, 趙曉霞 高 翔 高俊武 王靖宇

1 內蒙古自治區包頭醫學院口腔學院，內蒙古包頭市 014060； 2 內蒙古自治區包頭醫學院第一附屬醫院；3 內蒙古自治區呼和浩特市第一醫院

牙周炎發病率高，是成人失牙最主要的原因。能否有效控制感染并爭取病損部位最大限度地組織再生和重建是控制牙周炎病程進展的重要評價指標。隨著組織工程材料和技術的日新月異及生物信號分子研究的快速進步，牙周組織再生進入了蓬勃發展的時代[1]。存在于牙周韌帶組織的人牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)增殖能力旺盛且具有多向分化潛能，經誘導可形成牙骨質/牙周膜樣結構[2]。hPDLSCs被認為是牙周組織工程中最理想的種子細胞，已成為牙周組織的再生、種植體周圍缺損的修復以及正畸牙齒微環境改建過程中重要的細胞學基礎[3]。hPDLSCs主要來源于健康的乳牙及年輕恒牙，然而成年人中約80%罹患慢性牙周炎，其中20%為重度牙周炎。對于這些患者，能否從炎癥狀態下的牙周韌帶中成功分離得到自體健康的hPDLSCs；長期慢性炎癥對hPDLSCs的細胞表型、增殖能力及干細胞生物學特性有無改變[4-6]都影響著i-hPDLSCs的臨床應用。常規方法分離和純化i-hPDLSCs的成功率較低。本實驗采用改良酶消化組織塊蓋玻片培養法結合有限稀釋克隆法分離和篩選i-hPDLSCs，獲得單細胞克隆i-hPDLSCs，并在擴增后鑒定其生物學特性，以期為組織工程牙周再生治療的種子細胞的篩選與培養提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 30～45歲慢性牙周炎患者因重度牙周炎需拔除的患牙，由包頭醫學院第一附屬醫院口腔科提供；DMEM培養基、胎牛血清(Gibco，美國)；青、鏈霉素(華北制藥)；Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國)、0.25%胰蛋白酶-EDTA(Hyclon，美國)；小鼠抗人角蛋白、小鼠抗人波形絲蛋白、小鼠抗人STRO-1單克隆抗體(Dako，美國)、羊抗小鼠IgG-FITC熒光二抗、羊抗小鼠IgG-TRITC熒光二抗(Sigma，美國)、熒光染料Hoechst33258(Sigma，美國)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma，美國)、二甲基亞砜(DMSO，Amresco，美國)。倒置相差顯微鏡及照相系統(Olympas，日本)；熒光顯微鏡(BX61+DP-71，Olympus，日本)；酶聯免疫監測儀(SpectraMax M2，Molecular Devices，美國)。

1.2 改良法分離培養i-hPDLSCs

1.2.1 標本納入標準：30～45歲慢性牙周炎患者因嚴重的牙周炎需要拔除的患牙，無明顯齲壞、牙髓和根尖周病變，無黏膜疾患，且所有納入個體均無全身系統性疾病。嚴重慢性牙周炎的診斷標準(需拔牙的指征):X線片顯示牙槽骨吸收達根長的2/3，牙齒Ⅲ度松動。患者知情同意，簽署知情同意書。

1.2.2 通過酶消化組織塊蓋玻片法培養獲得人牙周膜細胞：75%乙醇消毒牙齒周圍組織，牙拔除后2h內取材。在超凈臺內以PBS沖洗牙根3～5次，刮除根中1/3部位的牙周韌帶組織，剪碎成1mm3大小，用3mg/ml的Ⅰ型膠原酶37℃下振蕩消化1h，離心吹勻后移入6孔板中。輕柔地覆蓋上蓋玻片，保持蓋玻片和組織塊之間有培養基充盈，補加2ml培養基，每3d換液。細胞融合達到80%時傳代。

1.2.3 有限稀釋法克隆化分離純化i-hPDLSCs：將P1代對數生長期的牙周韌帶細胞調整密度至10～15個細胞/ml，每孔100μl接種于96孔板。培養8～12h后，觀察選取并標記單個細胞孔。每個孔中加入200μl含有10%FBS的DMEM培養基，隔天換液。待標記孔的細胞增殖達到孔底面積1/3～1/2 時，消化傳代，取P4代細胞用于后續實驗。

1.3 i-hPDLSCs的生物學性狀鑒定

1.3.1 細胞來源鑒定：取P4代i-hPDLSCs制備細胞載玻片，通過免疫熒光染色鑒定角蛋白和波形絲蛋白。其中一抗為小鼠抗人角蛋白(PCK)和小鼠抗人波形絲蛋白(vimitin)。PBS漂洗細胞爬片，多聚甲醛固定，牛血清白蛋白封閉，加入一抗后于濕盒中過夜。次日，避光條件下加入山羊抗小鼠IgG-TRITC熒光二抗繼續孵育1h，用Hoechst33258對細胞核復染，甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.2 早期間充質干細胞標志物(STRO-1)的免疫熒光檢測：特異性一抗是小鼠抗人STRO-1單克隆抗體，二抗是山羊抗小鼠IgG-FITC熒光二抗，熒光染料Hoechst33258用于細胞核染色。具體方法同1.3.1。

1.4 克隆形成實驗 將i-hPDLSCs調整密度為103個細胞/皿接種于直徑為90mm的培養皿。十字方向輕搖、混勻細胞，連續培養14d后，通過倒置相差顯微鏡觀察和計數超過50個細胞的克隆數，計算克隆形成率(Colony forming unit-fibroblastic，CFU-F)。克隆形成率(%)= 克隆數/接種細胞數×100%。

1.5 細胞增殖能力 取生長良好的P4代i-hPDLSCs，將密度調整為2×104/cm2，每孔100μl接種于96孔板中，分別培養1、3、5、7、9d，每組設3個重復孔。培養完成后，每孔加入20μl MTT溶液培養4h后，棄上清、向每孔加150μl DMSO，振蕩10～15min。通過酶聯免疫吸附測定490nm的波長下每孔OD值，以時間作為橫坐標，OD值為縱坐標繪制生長曲線。

1.6 流式細胞儀分析細胞周期 取P4代i-hPDLSCs消化、計數并收集約3×106個吹散制成單細胞懸液，離心后加入70%乙醇吹打混勻，4℃過夜。離心棄去乙醇，避光加入50μg/ml的碘化丙錠1ml，4℃下染色30min，通過200目尼龍篩網，測定細胞周期。

2 結果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察i-hPDLSCs的形態 培養7～14d，可見長梭或多邊形的成纖維細胞樣細胞出現，貼壁生長，較分散(圖1A)。21d后，細胞數量增多并逐漸融合，形態均一，呈長梭形，長滿孔底面積60%～70%(圖1B)。傳代后，細胞形態與原代相同，細胞胞體豐滿，胞漿均勻，束狀排布(圖1C)。

2.2 i-hPDLSCs的生物學性狀的檢測 i-hPDLSCs經免疫熒光染色檢測顯示：vimitin陽性表達，細胞漿呈紅染，胞核呈藍染(圖2A)；PCK陰性表達，胞漿未染色，僅見細胞核呈藍染(圖2B)。可知所培養細胞為間充質來源，未有上皮細胞污染。STRO-1陽性表達，細胞質和胞核都呈綠染，同時胞核也被Hoechest33258復染，故呈藍綠色(圖2C)。

2.3 克隆形成情況 將103個細胞接種在90mm培養皿中，次日觀察到單個長梭形的細胞貼壁(圖3A)。培養10d后出現細胞克隆，為30～50個細胞形成的較小的克隆，細胞排列中央緊密、周圍松散；集落間細胞相距較遠(圖3B)。繼續培養至第14天時，克隆狀生長的細胞集落變多且細胞量明顯增多，中央區域的細胞緊密接觸且邊界不清，呈放射狀或旋渦狀分布；外周區域細胞形態為長梭形或多邊形，排列較緊密(圖3C)。克隆形成率為31.87%，克隆形成能力較強。

圖1 倒置顯微鏡下觀察i-hPDLSCs

圖2 免疫熒光染色鑒定i-hPDLSCs的生物學性狀

2.4 細胞增殖情況 i-hPDLSCs的生長曲線呈“S”型：第1、2天時，OD值較小；細胞生長速度在第3天開始顯著增快，隨著培養時間的延長細胞數量和活性都逐漸增加；第7天時，OD值達峰值；在第9天,細胞增殖趨于平緩、進入平臺期(圖 4)。

圖3 倒置顯微鏡下觀察有限稀釋克隆法分離純化的i-hPDLSCs

圖4 MTT法分析i-hPDLSCs的增殖情況

2.5 流式細胞儀分析細胞周期 大多數細胞處于G0/G1期(87.89%)，即靜止期和DNA合成前期；G2期細胞占比為2.08%，S期細胞占比為10.03%。上述結果表明炎癥來源的i-hPDLSCs具有慢周期性的特點(圖5)。

圖5 i-hPDLSCs的細胞周期檢測結果

3 討論

牙周炎癥不可逆地侵襲和破壞牙周組織，引起附著喪失，最終導致牙齒松動、脫落。其治療的目的不僅是控制炎癥，更重要的是促進已受損牙周組織的再生、形成新附著，從而保存牙齒和恢復咀嚼。在再生醫學中，組織工程理論和技術的廣泛應用為牙周組織的修復和重建提供了新的思路。

hPDLSCs是從牙周韌帶分離出的間充質干細胞，具有高增殖能力和多重分化潛能。然而牙周韌帶中存在的干細胞數量較少且來源局限，自體獲取困難，尚難以滿足臨床應用的需要。許多嚴重的慢性牙周炎患者，由于治療效果差、預后不良，患牙不得不拔除。這些炎癥來源的患牙是否可以分離出可供臨床應用的i-hPDLSCs？如何使其體外培養、分離純化的成功率更高？干細胞的特征和多重分化潛能是否會發生變化？這些問題的答案對于牙周組織再生的研究至關重要。

Park JC等[7]和談珺等[8]分別從炎癥的牙周膜及牙槽窩炎性肉芽組織中分離出了干細胞，并證實其具有高增殖和克隆形成能力以及成骨和成脂分化能力。通過構建大鼠實驗性牙周炎的模型，Ohta S等[9]發現大鼠的牙周缺損部位可被由牙周韌帶殘余遷移而來的干細胞修復，并驗證了這些炎癥來源的干細胞具有成骨和成牙周膜的作用。牙周炎癥發生的區域是組織修復和破壞共存并互相轉化的復合環境，干細胞的培養、分離及純化方式尚無統一標準。用于hPDLSCs的傳統體外培養方法包括酶消化和組織塊法，但兩者都存在一些缺點。酶消化獲得的hPDLSCs具有間充質干細胞的特征，但細胞數量少；低貼壁率又限制著組織塊培養方法的成功率。一些研究結合組織塊法和酶消化法用于培養hPDLSCs，雖然成功率有所提高，但組織塊貼壁率低的問題尚未得到有效解決[10-11]。本實驗在此基礎上改良方法，用蓋玻片覆蓋酶消化的組織塊，結果證實組織塊不易游走、浮出，細胞貼壁率明顯提高。同時，本實驗采用有限稀釋克隆法分離純化得到的i-hPDLSCs，為單純的間充質細胞樣的梭形結構(經驗證vimitin陽性表達，PCK陰性表達)，顯著減少了上皮細胞混雜的情況。

目前尚無明確的研究結論給出一種或幾種特殊的hPDLSC標志物。2004年，Seo等最早成功分離獲得hPDLSCs,并使用早期間充質干細胞的標志物STRO-1[12]、CD146/MICU8作為PDLSCs的標志物。本實驗通過免疫熒光染色證實了i-hPDLSCs的STRO-1呈陽性表達。克隆形成能力反映了干細胞的自我更新能力，本實驗中，i-hPDLSCs經有限稀釋克隆法培養至第14天可見大量克隆狀生長的細胞集落，克隆形成率為31.87%，這表明在非常低密度的培養條件下，i-hPDLSCs也可表現出較強的自我復制能力。i-hPDLSCs的生長曲線呈“S”型，隨著培養時間延長至3～7d，細胞生長速度增快，細胞數和細胞活性也隨之逐漸增加。細胞周期是衡量增殖動力學的重要指標，本研究細胞周期檢測結果顯示，炎癥來源的i-hPDLSCs在G0/G1期居多，符合干細胞慢周期性的規律。

通過改良的酶消化組織塊蓋玻片培養法結合有限稀釋克隆，可以從慢性牙周炎患者離體牙的牙周韌帶中分離純化得到i-hPDLSCs，且該細胞具有強克隆形成能力和高增殖能力、具備成體干細胞所具有的細胞周期及表型。本實驗為研究i-hPDLSCs的臨床應用奠定了基礎，也充實和豐富了牙周組織工程種子細胞的培養和篩選方法。