牛結節性皮膚病ELISA檢測試劑盒驗證試驗

薛文 蘇曉慧 秦菊 努爾麥麥提·阿穆提 居馬別克·夏拉巴依 王文

摘 要 2019年8月12日，經國家外來動物疫病研究中心檢測，確診新疆伊犁州發生牛結節性皮膚病疫情，這是新疆首次發現該病。疫情確診后，對病牛所在縣及其相鄰縣全部牛只進行緊急免疫山羊痘疫苗。為了了解免疫后抗體水平，驗證檢測試劑盒特異性，選取3個規模化牛場及1個規模化羊場，采用雙抗原夾心酶聯免疫法，對76份牛血清樣本和36份羊血清樣本進行了檢測。結果顯示，測試的雙抗原ELISA檢測試劑盒，可以檢測到16份牛結節性皮膚病病毒感染抗體和21份山羊痘病毒免疫抗體，未能檢出山羊痘免疫牛血清中相關抗體。

關鍵詞 牛結節性皮膚病；抗體檢測；免疫抗體；LSDV 特異性抗體

2019年8月3日，新疆伊犁哈薩克自治州報告在伊犁察布查爾縣瓊博拉鎮入戶排查時，發現部分牛養殖戶有1-2頭發病，患牛皮膚出現廣泛性結節（疙瘩）、流鼻涕、流涎、食欲減退及發燒等臨床癥狀，初步診斷為疑似牛結節性皮膚病（LSD）。疫情確診后，采用國家批準的山羊痘疫苗（按照山羊的5倍劑量），對病牛所在縣及其相鄰縣全部牛只進行緊急免疫。為了驗證檢測試劑盒特異性，選取46份LSDV感染牛血清，66份免疫血清樣本（36份羊血清，30份牛血清），采用雙抗原夾心酶聯免疫法對血清樣本進行了檢測，為做好LSD防控提供一些數據支撐。

1 材料與方法

1.1 分組及樣品采集

1.1.1 感染組（牛結節性皮膚病感染抗體檢測）。在伊犁州霍城縣某發病牛場采集感染LSDV牛血清24份，在伊犁州察縣某發病牛場采集感染LSDV牛血清22份。

1.1.2 試驗羊組（山羊痘免疫抗體檢測）。選自新疆昌吉州奇臺縣某規模羊場，選取整群綿羊36只，采用皮內注射進行山羊痘疫苗第1次免疫，疫苗免疫40天后采集血樣。

1.1.3 試驗牛組（牛免疫山羊痘抗體檢測）。選自新疆伊犁州察縣1個鄉鎮規?；B殖場選取30頭，采用皮內注射進行山羊痘疫苗（按照山羊的5倍劑量免疫）第1次免疫，疫苗免疫30天后，采集血樣。

1.2 疫苗及檢測試劑

疫苗來源來自政府統一招標采購的山羊痘疫苗。

診斷試劑 羊痘屬抗體檢測試劑盒購自法國ID.VET公司，生產批號F05。

1.3 檢測方法

采用雙抗原夾心酶聯免疫法，以羊痘病毒純化抗原作為包被抗原，檢測牛、綿羊、山羊和其它敏感物種血清中的羊痘病毒、牛結節性皮膚病病毒、綿羊痘病毒、山羊痘病毒抗體。

1.4 儀器設備

全波長酶標儀（Thermo）、高速自動化清洗酶標板（瑞士帝肯）、微量移液器等。

2 結果

2.1 感染組

共檢測2個場點的46份牛血清樣品，檢出抗體陽性16份。

2.2 試驗羊組

共檢測1個場點的36份羊血清樣品，檢出抗體陽性21份。

2.3 試驗牛組

共檢測1個場點的30份牛血清樣品，檢出抗體陽性0份。

3 討論和建議

此次牛結節性皮膚病疫情為新疆首例。通過采取“免疫+改良捕殺”的防控策略，即在伊犁地區緊急免疫山羊痘疫苗（按照山羊的5倍劑量免疫），同時采取僅對發病牛進行捕殺的政策，限制動物移動。由于天氣轉冷蚊蟲等傳播媒介減少，LSD疫情呈明顯的季節性[1]。該疫情已得到有效控制。通過入戶排查結合熒光PCR試驗檢測，未發現新增LSD病例。

本次檢測用的雙抗原ELISA檢測試劑盒，未能檢出山羊痘免疫牛只血清中相關抗體。這可能是由于山羊痘疫苗為弱毒苗，主要是細胞介導，可在短時間內發生免疫作用，但抗體產生的滴度水平低。有報道顯示，首次免疫山羊痘活疫苗產生的抗體滴度不均，14-21天達到抗體水平峰值，51天左右出現免疫空擋，且免疫后期抗體滴度水平較低[2]，這與疫苗種類、畜禽機體、飼養管理等影響較大[3]。另一方面，山羊痘僅免疫牛只一次，產生抗體的滴度低，尤其是對輕度和持續期較長的LSDV感染，使用ELISA方法檢測抗體水平來評價疫苗免疫效果不佳。此外，皮內操作困難，容易注入肌肉，造成免疫效果不確實或免疫失敗[4]。

根據檢測結果，可以檢測到牛結節性皮膚病病毒感染抗體和山羊痘病毒免疫抗體，現階段該試劑盒可作為牛結節性皮膚病發病早期的血清學診斷方法和山羊痘免疫羊后抗體的檢測方法。建議首免21天后加強免疫一次，再進行抗體測定；同時采用中和試驗結合臨床觀察結果確認評價疫苗免疫保護效果。

參考文獻：

[1]袁麗萍，宋建德.2015-2016年歐洲牛結節性皮膚病流行狀況分析[J].中國動物檢疫，2017，34（8）：32-35.

[2]劉忠偉.山羊痘疫苗免疫保護能力試驗[D].貴州：貴州大學，2006：1-70

[3]程國奎，于建文，柴紹芳。山羊痘疫苗抗體時效性研究與探索[J]. 中獸醫醫藥雜志，2017，36（5）：56-57

[4]趙燕，柴紹芳，郭憲.山羊痘病毒的血清學檢測與PCR鑒定[J].中獸醫醫藥雜志，2018，37，（3）：63-64

第一作者：薛文（1987-），女，漢族，河南正陽，本科學歷，助理獸醫師，從事病毒性人獸共患病研究。

通訊作者：王文（1968-），女，農業推廣研究員，從事動物疫病監測和防控技術的研究。