非洲豬瘟實驗室檢測技術研究進展

吳丹 冬冬 李偉 張夏平 趙達卓

摘 要 非洲豬瘟作為一種新型的外來病毒，在我國發生疫情后迅速蔓延，引起了嚴重的豬養殖經濟損失，非洲豬瘟病毒也因此被我國定位一類動物疫情。該病具有高死亡率和高傳染性，最高時死亡率高達100%，與部分高溫疾病及豬瘟有類似之處，一般臨床經驗診斷較為困難，需要借助實驗室檢測技術確診。本文就來分析非洲豬瘟實驗室檢測技術研究進展。

關鍵詞 非洲豬瘟；實驗室檢測技術；研究進展

1 引言

2019年上半年我國豬肉價格在全國范圍內暴漲，平均豬肉價格漲幅高達9.3%。快速上漲的豬肉價格令市民措手不及。那么豬肉價格為什么會漲幅如此之快呢？原因是2018年我國爆發了非洲豬瘟，對養豬業造成了重大的打擊。大部分的中小規模養豬戶因此陷入經濟危機，遭到破產，資不抵債。

2 非洲豬瘟的臨床癥狀

非洲豬瘟有著較長的潛伏期，一般由2-9天，平均持續時間四天，從病發到死亡僅需要2-7天。最明顯的臨床癥狀就是高熱癥狀。患有非洲豬瘟的病豬體溫最高是達到41℃，病豬臨死前48小時體溫開始下降。此外，病豬表現為食欲不振、行動虛弱、脈搏較快、呼吸加速并伴隨呼吸困難，咳嗽加重，還會患有結膜炎，伴隨嘔吐、下痢。臨床解剖檢驗，發現血紅代辦遞減50%，隨著體溫升高具有白血球性貧血癥，身體匯總的淋巴球數量也相應減少，最低時下降至40%。身體上表現為蹄、尾、會陰、腹部、腋下、鼻、耳朵乳頭等部位掉毛，并發生紫色斑。生斑部位發生腫脹，斑點中心部位發生分散性出血癥狀。解剖可見內臟多處部位膜內發生紅色瘀斑，胸膜部位發生新報出血，多處淋巴部位發生結節。此外，脾臟系統發生栓塞和腫脹，血液循環系統發生多處充血，呼吸系統發生擴散性充血或瘀斑[1]。

3 非洲豬瘟實驗室檢測技術

3.1 病原學檢測

3.1.1 病毒分離鑒定

非洲豬瘟病毒分離需要在具有三級以上生物安全的實驗室進行。主要包括分離病死豬的心臟、脾臟、肝臟等組織器官，用于分離病毒細胞。感染非洲豬瘟病毒的病豬單層豬外周血單核細胞具有血細胞吸附特性及細胞死亡的特征。檢測到細胞呈陽性時則可確診為感染ASFV病毒。

3.1.2 熒光抗體試驗

將采集的白雪細胞培養物圖片使用ASFV抗原進行鑒定，用熒光標記抗體分離兵卒，特異性高則為感染非洲豬瘟。該實驗室檢測方法檢測準確性高，見效快，但由于熒光顯微鏡、熒光標記抗體價格較快，因此檢測應用范圍受到限制。

3.1.3 紅細胞吸附試驗

非洲豬瘟的血紅細胞通過抗血清阻斷吸附病毒，抗體對同源病毒產生抑制，紅細胞吸附實驗用于鑒定抗原的差異性和抗體的效價。大部分的非洲豬瘟分離后具有HAD活性，這類病毒本身不具有致病性。但是這類病毒能夠在白細胞培養的過程中發生病變，缺乏紅細胞吸附能力，而這類病毒具有致病性。再對血紅細胞的吸附性進行鑒定，檢測病毒的敏感性，病毒的敏感性月為92%，這說明存在致病性非洲豬瘟病毒。使用該方法檢測非洲豬瘟病毒，檢測時間最快也需要3天，長則需要10天，因此不適用于緊急情況病毒檢測。

3.2 血清抗體檢測

3.2.1 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附實驗是建立在便宜學反應基礎上的。通過抗體、抗原的反應與酶對底物高效催化反應的敏感性來監測免疫反應。2014年，董志珍應用基因重組制備非洲豬瘟病毒，從小白鼠身上獲得單克隆抗體，并通過競爭法ELISA檢測非洲豬瘟病毒的特異性，特異性高且無交叉性，其靈敏度為100%。該方法主要用于非洲豬瘟流行病學的檢測，肥豬豬瘟抗體具有阻斷ELISA、間接ELISA。

3.2.2 膠體金免疫層析技術

該技術將膠體金作為示蹤標志物，是一種檢測抗原抗體的免疫標記技術。2017年，林彥星等人合成多肽，并將其與牛血清白蛋白進行偶聯，從中選出具有抗原性的多肽檢測非洲豬瘟抗體膠體金免疫層析紙條。膠體金免疫層析技術具有較強的敏感性和特異性，試紙檢測方便、快捷，應用范圍較廣。膠體金免疫層析試紙檢測非洲豬瘟病毒的準確率高達100%，是快速檢測非洲豬瘟最有效的方法，在臨床診斷非洲豬瘟方面有著及其廣泛的應用[2]。

3.2.3 間接免疫熒光試驗

該技術是利用特異性抗體與標本中相的抗原反應來用熒光標記抗體檢測病毒的方法。1970年，Sanchez建立了非洲豬瘟抗體IIF檢測技術。由于IIF具有較高的敏感性，因此使用該技術檢測非洲豬瘟病毒的時間較短。在實際的應用中，由于酶聯免疫吸附試驗的檢測結果不穩定，受環境因素影響較大，因此會產生非特異性染色，從而影響檢測結果。

3.3 分子生物學檢測

分子生物學檢測主要指核酸檢測法。PCR核酸檢測技術是一種高敏感性、高特異性檢測技術，且操作簡單，檢測成本較低，在非洲豬瘟早期病毒診斷方面有著及其廣泛的應用。非洲豬瘟病毒基因中含有保守基因序列，根據非洲豬瘟病毒特異性擴增，檢測器核酸章臺。使用分子生物學檢測非洲豬瘟，檢測無可以是病豬的分泌物、血液、組織等，不僅對于檢測樣本要求不高，且檢測效果靈敏、迅速。分泌物、血液屬于相對易采集的監測樣本，在早期非洲豬瘟病毒診斷檢測方面適用性較好。目前，分子生物監測法主要選取非洲豬瘟的P72基因進行檢測，它具有高度保守序列設計出引物，從中就可提取出病毒樣本[3]。

4 結語

綜上所述，非洲豬瘟實驗室檢測技術是目前防控非洲豬瘟最有效的方法。鑒于上一次國內爆發的非洲豬瘟及其因此而造成的慘重的損失，現階段，農業部門應該聯合養殖戶做好豬的自檢與抽檢，確保健康豬肉的流通，為消費者提供品質保障的豬肉，同時也優化養豬環境，維持我國養豬業健康平穩發展。

參考文獻：

[1]王子堅，賀奮義，郭慧琳，魏潤生.非洲豬瘟檢測技術研究進展[J].國外畜牧學（豬與禽），2016（01）：48-49.

[2]劉賀.非洲豬瘟診斷技術研究進展[J].動物醫學進展，2019（07）：108-110.

[3]莊金秋，梅建國，謝金文，李峰，沈志強.非洲豬瘟病毒實驗室檢測方法研究進展[J].飼料與畜牧，2017（22）：32-36.