大蒜素對急性心肌缺血再灌注后心律失常和心功能影響的實驗研究

俞飛虎 李紅霞 蘇斌杰 陳振云 劉祖秋 熊海剛 陳華山 周萬青

急性心肌梗死是指冠狀動脈狹窄所致持續性缺血缺氧而引發心肌缺血性壞死，繼而出現心力衰竭、惡性心律失常甚至猝死，是臨床上較為常見的急危重癥[1-2]。及時恢復血流再灌注是臨床上的首選治療方案，但再灌注后所引發的室性心律失常以及心功能急劇減退是導致心源性猝死的主要原因[3]。大蒜素是一種二烯丙基三硫化物，研究發現大蒜素能夠通過抑制氧化應激損傷、改善血流動力學對心肌缺血再灌注大鼠起到一定的保護作用[4-6]。但大蒜素對心肌梗死再灌注后心律失常和心功能的影響鮮有報道。維拉帕米是一種鈣離子拮抗劑，能夠通過抑制鈣離子內流而減輕缺血再灌注損傷[7]，是臨床上治療心肌缺血再灌注損傷的常用藥物，并常作為陽性對照藥物用于心肌缺血再灌注損傷的動物實驗研究[8]。本實驗擬通過結扎冠狀動脈左前降支復制大鼠心肌缺血再灌注模型，研究大蒜素對大鼠心肌缺血再灌注后心律失常和心功能的影響，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級建康成年雄性SD 大鼠120只，體質量250～300g，購自寧波大學實驗動物中心[SYXK（浙）2014-0005]，動物合格證號：20181207016。實驗前清潔環境飼養1 周，光照：黑暗時間為1∶1，室溫（25±1）℃，相對濕度（60±10）%。

1.2 試驗藥物與試劑 包括大蒜素注射液（黑龍江江世藥業有限公司，規格：2ml ∶30mg，批號：20181006）；鹽酸維拉帕米注射液（黑龍江多多藥業有限責任公司，規格：2ml∶5mg，批號：180917）；天冬氨酸轉氨酶（AST）、肌酸磷酸激酶（CPK）、乳酸脫氫酶（LDH）（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，批號：20180409、20181004、20181012）；Na+-K+-ATP酶試劑盒、Ca2+-Mg2+-ATP 酶試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號：20180524、20181012）；一氧化氮合酶（NOS）、一氧化氮（NO）試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：20161229、20170316）；鈣標準液（上海生物制品研究所，批號：180726）；紅四氮唑（TTC）（北京化學試劑公司，批號：171209）。

1.3 實驗儀器 包括DH-150 型動物呼吸機（浙江大學醫學儀器有限公司）；BL-420E 型生物信號采集儀（成都泰盟科技有限公司）；Vevo770 型超高分辨率小動物超聲實時分子影像系統（加拿大Visual-Sonics 公司）；BH-2 型倒置光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；BS-200 型全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；RM2125 型組織切片機（德國Leica 公司）；Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統（北京麥克奧迪儀器儀表有限公司）；DU700 型紫外-可見分光光度計（美國Beckman Coulter 公司）。

1.4 方法

1.4.1 動物分組、模型制備與給藥 按照隨機數字表法將120 只大鼠分為假手術組（0.9%氯化鈉溶液）、模型組（0.9%氯化鈉溶液）、大蒜素低[5mg/（kg·d）]、中[10mg/（kg·d）]、高[20mg/（kg·d）]劑量組和維拉帕米組[2.5mg/（kg·d）]，各20 只。參照張衛強等[9]的手術方法復制心肌缺血再灌注大鼠模型：以50mg/kg 劑量腹腔注射1.2%戊巴比妥鈉溶液實施麻醉，取仰臥位，行二導聯心電圖實時監測，氣管切開并連接動物呼吸機（參數設置：頻率60 次/min、潮氣量20ml/kg、呼吸比1.5∶1）；于左胸第3～4 肋骨間切開皮膚、鈍性分離開胸，充分暴露心臟、剪開心包膜，于左心耳下緣約2mm 處動脈夾夾閉冠狀動脈左前降支，以左心室前壁顏色呈灰白至紫紺、心電圖ST段抬高或T 波高聳為造模成功標志，以20 萬U/kg劑量局部給予青霉素預防感染，30min 后松開動脈夾，然后逐層縫合；假手術組除了不結扎冠狀動脈左前降支外，其余操作與模型組相同。大蒜素低、中、高劑量組和維拉帕米組給藥方法：各組大鼠均于術后第2 天開始腹腔注射給藥，1 次/d，療程4 周。

1.4.2 心律失常情況監測及評分 監測并記錄Ⅱ導聯心電圖PR 間期、QRS 間期以及ST 段變化，計算室性心動過速（VT）、心室顫動（VF）發生率；依照李濤等[10]的心律失常評分標準：＜5 次室性前期收縮，計0 分；≥5 次室性期前收縮，計1 分；一陣＜60s VT，計2 分；一陣≥60s VT 或多陣VT 但累計＜60s VT，計3 分；多陣VT 累計＞60s，計4 分；出現VF，計5 分。

1.4.3 心功能監測 通過超高分辨率小動物超聲實時分子影像系統進行心功能檢測：取左心室乳頭肌水平短軸切面，測量指標包括：左心室舒張末期內徑（LVEDd）、左心室收縮末期內徑（LVESd）、左心室短軸縮短率（LVFS）、左心室射血分數（LVEF）、每搏輸出量（SV），均連續測量3 個心動周期后取平均值。

1.4.4 心肌組織病理學檢查 采用隨機數字表法在6 組大鼠中各取6 只大鼠，腹腔注射1.2%戊巴比妥鈉溶液麻醉后開胸取心臟組織，切取左心室部位置4%多聚甲醛溶液繼續固定72h。經固定的左心室組織進行石蠟包埋和切片，切片厚度2μm，經二甲苯透明、梯度酒精脫蠟水化處理，然后行HE 染色：蘇木精溶液浸泡5min，水沖洗2 次各30s，PBS 溶液返藍，水沖洗30s，伊紅溶液浸泡30s，然后行梯度酒精脫水、二甲苯透明處理、中性樹膠封片，倒置光學顯微鏡觀察并照相保存。

1.4.5 血清心肌酶水平測定 在1.4.4 步驟取心臟前，由腹主動脈取動脈血并經1 500r/min 離心10min 后取血清，經全自動生化分析儀測定血清AST、CPK、LDH 水平。

1.4.6 心臟指數和梗死體積百分比測定 采用隨機數字表法在6 組大鼠中各取6 只大鼠，麻醉后稱體質量，開胸取心臟后稱質量，然后計算心臟指數（心臟質量/體質量）；心臟稱重后立即置于-20℃冰箱凍存0.5h，進行心臟組織切片，厚度為2mm，浸入預配置好的恒溫37℃濃度1%的TTC 溶液中，避光孵育0.5h，每5min 翻動切片一次使之均勻著色。染色后灰白色為心肌梗死區、紅色為正常組織，拍照后應用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統計算切片梗死面積，腦梗死體積百分比（%）=（梗死面積×切片厚度/切片面積×切片厚度）×100%。

1.4.7 心肌生化指標測定 取各組剩余8 只大鼠，麻醉后迅速開胸取心臟組織，于冰上剪碎后置離心管并加入9 倍量RIPA 蛋白裂解液，冰水浴中研磨勻漿，低溫高速離心（4℃，12 000r/min）15min 后取上清液，嚴格按照試劑盒說明步驟處理后，通過紫外-可見分光光度計測定Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性；通過原子吸收光度計測定心肌細胞內Ca2+濃度；采用催化L-Arg 比色法測定NOS 活性，硝酸酶還原法檢測NO 含量。

1.5 統計學處理 采用SPSS15.0 統計軟件，計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心電圖結果比較 見表1。

表1 各組大鼠心電圖結果比較

由表1 可見，與假手術組比較，模型組心電圖PR 間期、QRS 間期縮短、ST 段抬高，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組和維拉帕米組PR 間期、QRS 間期延長且ST段降低（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高劑量組PR 間期、QRS 間期及ST 段高度與維拉帕米組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.2 各組大鼠心律失常情況及評分比較 見表2。

表2 各組大鼠心律失常情況及評分比較

由表2 可見，與假手術組比較，模型組VT、VF發生率及心律失常評分升高，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組和維拉帕米組VT、VF 發生率降低（均P＜0.01），心律失常評分降低（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高劑量組心律失常評分較維拉帕米組降低（P＜0.05），VT、VF 發生率差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.3 各組大鼠心功能指標比較 見表3。

表3 各組大鼠心功能指標比較

由表3 可見，與假手術組比較，模型組LVEDd、LVESd 升高，LVFS、LVEF、SV 降低，差異均有統計學意義（P＜0.05 或0.01）；與模型組比較，大蒜素高劑量組和維拉帕米組LVEDd 降低（均P＜0.05），大蒜素中、高劑量組和維拉帕米組LVESd 降低，LVFS、LVEF、SV 升高（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高劑量組各指標與維拉帕米組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.4 各組大鼠心肌組織病理學檢查結果 見插頁圖1。

由插頁圖1 可見，假手術組心肌纖維條理清晰呈束狀，細胞形態規則、結構完整、排列有序；與假手術組比較，模型組呈現心肌纖維條理不清，出現斷裂和紊亂，細胞數量減少、部分細胞壞死，炎性細胞浸潤等病理性改變；大蒜素低、中、高劑量組和維拉帕米組較模型組心肌纖維及心肌細胞上述病變均有所減輕，其中以大蒜素高劑量組最為顯著。

2.5 各組大鼠血清心肌酶水平比較 見表4。

表4 各組大鼠血清心肌酶水平比較

由表4 可見，與假手術組比較，模型組血清AST、CPK、LDH 水平升高，差異均統計學意義（均P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組和維拉帕米組血清LDH 水平降低（P＜0.05 或0.01），大蒜素中、高劑量組和維拉帕米組血清AST、CPK水平降低（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高劑量組LDH水平較維拉帕米組降低（P＜0.05），AST、CPK 水平差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.6 各組大鼠心臟指數和梗死體積百分比比較見表5。

由表5 可見，與假手術組比較，模型組心臟指數和梗死體積百分比均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組和維拉帕米組心臟指數和梗死體積百分比均降低（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高劑量組心臟指數、梗死體積百分比與維拉帕米組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

表5 各組大鼠心臟指數和梗死體積百分比比較

2.7 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+- ATP 酶活性及細胞內Ca2+濃度比較 見表6。

表6 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性及細胞內Ca2+濃度比較

由表6 可見，與假手術組比較，模型組Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性降低而細胞內Ca2+濃度升高，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組和維拉帕米組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性升高且Ca2+濃度降低（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高劑量組Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性較維拉帕米組升高（P＜0.05），Na+-K+-ATP 酶活性和Ca2+濃度差異均無統計學意義（均P＞0.05）。2.8 各組大鼠心肌組織NOS 活性及NO 含量比較見表7。

表7 各組大鼠心肌組織NOS 活性及NO 含量比較

由表7 可見，與假手術組比較，模型組NOS 活性和NO 含量均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素低中、高劑量組NOS 活性及NO 含量均升高（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高劑量組NOS 活性和NO 含量較維拉帕米組均升高（P＜0.05 或0.01）。

3 討論

目前，通過藥物溶栓或經皮冠狀動脈介入（PCI）等技術手段恢復血流再灌注、搶救缺血區心肌細胞、縮小梗死面積，仍是臨床上救治急性心肌梗死患者的首選治療方案[11]。但再灌注后所引發的惡性心律失常以及心功能急劇減退是導致心源性猝死的主要原因，這也為研發改善急性心肌梗死患者預后的新型藥物提供了新的靶點。

大蒜素是一種天然存在的二烯丙基三硫化物。王瑞等[12]研究發現大蒜素能夠降低高血脂癥患者血脂和體重指數，張昆[13]研究發現大蒜素能夠改善血流動力學和血液流變學。本實驗通過復制急性心肌缺血再灌注大鼠模型并給予大蒜素進行干預治療，發現經大蒜素治療能夠有效改善心肌缺血再灌注大鼠心電波形（PR 間期、QRS 間期延長且ST 段降低），抑制心肌組織病理學改變，減小心肌梗死體積、降低心臟指數（減輕心臟組織水腫），且高劑量大蒜素對心肌組織病變的抑制作用優于維拉帕米，提示大蒜素對心肌缺血再灌注大鼠心臟組織具有一定的保護作用。

VT 和VF 是最常見的心律失常表征。本研究經心電監測，發現經大蒜素治療能夠有效降低心肌缺血再灌注大鼠VT、VF 發生率，明顯降低心律失常評分，并且大蒜素高劑量組心律失常評分顯著低于維拉帕米組，提示大蒜素對大鼠心肌缺血再灌注后心律失常具有明顯的抑制作用。

LVEDd、LVESd、LVFS、LVEF、SV 能夠反應心臟組織功能；正常生理狀態下，血清心肌酶（AST、CPK、LDH）水平極低，當心肌細胞受損后細胞內心肌酶釋放入血，導致血清心肌酶水平陡增，所以血清心肌酶水平能夠敏感反映心肌細胞及心功能受損程度[14]。本實驗發現，經大蒜素治療能夠有效降低心肌缺血再灌注大鼠心臟LVEDd、LVESd 并升高LVFS、LVEF、SV，降低血清AST、CPK、LDH 水平，且大蒜素高劑量組降低血清LDH 作用優于維拉帕米組，提示大蒜素具有改善心肌缺血再灌注大鼠心功能的作用。

能量耗竭是心肌缺血再灌注后引發心律失常的病理機制。首先，能量代謝障礙所致ATP 合成受阻、ATP 依賴性的Ca2+-Mg2+-ATP 酶活力降低、細胞內Ca2+泵出能力下降，導致心肌細胞Ca2+超載進而引發心律失常[15-16]；其次，ATP 合成受阻將導致Na+-K+-ATP 酶活力進一步降低[17]、細胞外K+增多，導致缺血中央至邊緣區K+含量逐漸下降的不均勻分布態勢，這也是導致心律失常的重要原因之一。本實驗研究發現，經大蒜素治療能夠明顯改善急性心肌缺血再灌注大鼠心肌組織Ca2+-Mg2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP 酶活力并降低心肌細胞Ca2+濃度，且大蒜素高劑量組對Ca2+-Mg2+-ATP 酶活力的改善作用優于維拉帕米組，這可能是大蒜素降低大鼠急性心肌缺血再灌注后心律失常發生率的重要分子機制。

NO 是體內非常重要的信號傳導因子，具有擴張血管、增加冠狀動脈血流量、改善缺血區血流灌注、提高心肌細胞氧供/需比等而抑制心律失常發作的生理作用[18]；而NOS 是體內促NO 生成的關鍵酶。本研究發現，經大蒜素治療能夠有效改善急性心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞NOS 活性并提高NO含量，這可能也是大蒜素抑制心肌缺血再灌注后心律失常的重要分子機制之一。

綜上所述，大蒜素對大鼠急性心肌缺血再灌注后心律失常和心功能均具有明顯的改善作用，其作用機制可能與大蒜素改善心肌組織Ca2+-Mg2+-ATP酶和Na+-K+-ATP 酶活力、降低心肌細胞Ca2+濃度、提高NO 含量有關。