超聲微泡介導MaFGF 對阿霉素心力衰竭大鼠心功能的保護作用及其機制研究

倪賢偉 田新橋 趙應征 鄭磊 李劍敏

Lefrak 于1973 年率先報道阿霉素具備心臟毒性，提出其危險性相較腎臟毒性、消化道不良反應、骨髓抑制等更高[1]。阿霉素療法存在致心臟毒性風險，最嚴重的一類并發癥為心力衰竭（簡稱心衰）。改構型酸性成纖維細胞生長因子（modified acidic fibroblast growth factor，MaFGF）是通過基因工程技術去除酸性成纖維細胞生長因子（acidic fibroblast growth factor，aFGF）促分裂活性并保留非促分裂活性的突變體[2]，與aFGF 具有同等的心肌保護效應[3]，如抵抗氧化應激、抑制心肌細胞凋亡等[4]。本研究應用超聲靶向微泡擊破技術（ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD）靶向介導MaFGF 對阿霉素誘導心肌損傷大鼠進行干預，采用超聲心動圖檢查，測定心肌丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）含量，通過Masson 膠原染色及透射電鏡等檢查評價該方法對阿霉素心衰大鼠心功能的保護作用并探討其機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康雄性SPF 級SD 大鼠共40只，鼠齡40～50d，體重（210±24）g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗儀器與試劑 超聲診斷系統為Acuson Sequoia 512C（美國Siemens 公司），探頭：15L8w-S線陣，頻率：12～14MHz，內部配裝RT-MCE 造影軟件。MaFGF 凍干粉為溫州醫科大學生物和天然藥物開發中心有限公司提供；微泡造影劑采用SonoVue微泡（意大利Bracco 公司）；鹽酸阿霉素購自大連美侖生物有限公司；SOD 與MDA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司；Masson 三色染色液購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SonoVue-MaFGF 混懸液配制 稱量MaFGF凍干粉30μg，添加0.9%氧化鈉溶液5ml，小幅振搖使徹底溶解，即得到MaFGF 溶液，然后移入SonoVue瓶（已含SonoVue 凍干粉）內，待混合，于室溫中進行10～20min 靜置孵育處理，此過程中小幅振蕩若干次，最后得到SonoVue-MaFGF 混懸液[5]。參考課題組以往實驗結果，此項目所制備的SonoVue-MaFGF 混懸液所含MaFGF 量控制為6μg/ml。

1.3.2 動物造模及分組 40 只SD 大鼠通過隨機區組法歸入以下4 組：正常對照組、HF 模型組、MaFGF組、MaFGF+UTMD 組，每組10 只。后3 組實驗動物根據體重，將3mg/kg 鹽酸阿霉素由腹腔注入體內，每周1 次，共6 周，注射量合計為18mg/kg，正常對照組注射等容積的0.9%氯化鈉溶液。動物實驗均得到溫州醫科大學動物倫理委員會審核通過。

1.3.3 實驗處理 MaFGF+UTMD 組大鼠腹腔注入戊巴比妥鈉（3%）麻醉，之后剃除心前區毛發，將探頭放在其心前區，超聲切面為乳頭肌水平左心室短軸，設定3.5～4.0cm 聚焦深度，分別經尾靜脈注射0.1ml SonoVue-MaFGF 混懸液，當數量可觀的微泡充盈心肌內部時，借助設備自帶微泡爆破功能對微泡實施若干次重復爆破處理，期間機械指數（MI）設定為1.9，待微泡徹底消失結束。MaFGF 組大鼠經尾靜脈注入MaFGF 溶液0.1ml。正常對照組和HF 模型組大鼠尾靜脈注入0.1ml 0.9%氯化鈉溶液，每周分別在注入鹽酸阿霉素后的第4、6 天實施上述干預，共6 周。

1.3.4 超聲心動圖檢查 干預6 周后，各組實驗動物依次接受麻醉（經腹腔注入3%戊巴比妥鈉）、胸前區剃毛處理，使其呈左側臥位，并在固定板上固定，將探頭放在其心前區，行超聲心動圖檢查，測量各組大鼠左心室收縮末期內徑（LVESd）、左心室舒張末期內徑（LVEDd）、左心室短軸縮短率（LVFS）以及左心室射血分數（LVEF）。

1.3.5 MDA、SOD 水平測定 處死大鼠后，取部分大鼠左心室心肌組織，加入冷0.9%氯化鈉溶液，使0.9%氯化鈉溶液總體積：心肌組織重量為9∶1（1g可換算為1ml），借助眼科小剪刀迅速剪碎組織塊，接著于碎冰內對組織實施研磨。對完成配制10%組織勻漿實施10min 離心處理，3 000r/min、4℃，取適量上清液待檢測。采用BCA 試劑盒測定心肌總蛋白含量，根據MDA、SOD 兩試劑盒所示操作測定心肌組織MDA 和SOD 水平。

1.3.6 Masson 膠原染色 收集大鼠心臟組織，接著實施1d 固定（固定液為4%多聚甲醛），之后石蠟包埋，切片（厚度為5μm），進行Masson 膠原染色，置于高分辨率光學顯微鏡下觀察心肌纖維化狀況，各組12 張切片，隨機選擇各切片內20 個400 倍視野，應用IPP 6.0 軟件測量心肌膠原容積分數（CVF）、血管周圍膠原面積（PVCA）/血管腔面積（LA）比值。

1.3.7 透射電鏡觀察 大鼠心肌組織采用鋨酸固定，丙酮梯度脫水（70%、80%、90%），環氧樹脂浸透包埋、聚合，通過超薄切片機得到超薄切片，通過透射電鏡觀察心肌細胞超微結構。

1.4 統計學處理 采用SPSS20.0 統計軟件，計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），方差齊性者兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊者進行Dunnet’sT檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠超聲心動圖檢查結果比較 見表1。

表1 各組大鼠超聲心動圖檢查結果比較

由表1 可見，HF 模型組LVESd、LVEDd 較正常對照組升高，LVEF、LVFS 則降低（均P＜0.05）；經過6 周干預，MaFGF 組、MaFGF+UTMD 組LVEF、LVFS較HF 模型組均升高，LVESd、LVEDd 則降低（均P＜0.05）；MaFGF+UTMD 組LVEF、LVFS 較MaFGF組均升高（均P＜0.05）。

2.2 各組大鼠心肌組織MDA、SOD 水平比較 見表2。

表2 各組大鼠心肌組織MDA、SOD 水平比較

由表2 可見，HF 模型組心肌組織SOD 水平較正常對照組降低，MDA 則升高（均P＜0.05），MaFGF組及MaFGF+UTMD 組心肌組織MDA 水平較HF模型組下降、SOD 則升高（均P＜0.05）。與MaFGF組相比，MaFGF+UTMD 組心肌組織SOD 水平升高（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠心肌組織Masson 膠原染色結果 見插頁圖1、2 及表3。

表3 各組大鼠心肌組織CVF 與PVCA/LA 比較

由插頁圖1、2 可見，紅細胞、纖維束與肌纖維均顯紅色，心肌膠原纖維則顯藍色。與正常對照組比較，HF 模型組CVF、PVCA/LA 均升高（均P＜0.05），MaFGF 及MaFGF+UTMD 組心肌組織CVF 和PVCA/LA 較HF 模型組下降（均P＜0.05），而與MaFGF 組相比，MaFGF+UTMD 組心肌組織CVF 和PVCA/LA 下降更明顯（均P＜0.05）。

2.4 各組大鼠心肌組織透射電鏡檢測結果 見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織透射電鏡結果（A：正常對照組；B：HF 模型組；C：MaFGF 組；D：MaFGF+UTMD 組；×10 000）

由圖3 可見，正常對照組各肌絲分布整齊，未見異常線粒體形態，為單行分布，附近無明顯空泡產生。與正常對照組比較，HF 模型組經6 周干預，心肌各肌絲分布喪失齊整性，且線粒體無規律分布，腫脹變形，附近存在空泡；但是經過6 周MaFGF 干預，心臟微觀逐漸好轉，尤其MaFGF+UTMD 組心臟肌絲與肌纖維分布較為整齊，未見異常線粒體形態，且規則分布，肌絲附近空泡量大幅下降。

3 討論

心衰是阿霉素療法危險性最大的一類并發癥，臨床雖有包括心臟移植、支持治療在內的若干治療方案，但心衰患者無法得到良好預后，且存在較高致死率。而由鹽酸阿霉素誘導的心衰發生的具體發病機制還未完全闡明，現今認為是由諸多因素（包括氧化應激、溶酶體改變、炎性反應、心肌電解質紊亂等）協同作用所致[6]。然而，由氧自由基（oxygen free radical，OFR）產生所致氧化應激提升一直被視作阿霉素導致心衰的關鍵環節[6]。因此，減少氧自由基產生和抗氧化應激治療成為防治心衰的重要策略。

已有研究發現，aFGF 高表達于心臟組織，在心臟發育、心肌細胞凋亡受抑、增強心肌細胞增生分化、抗氧化應激、促心肌毛細血管產生[7]等方面發揮一定作用，所以，在治療心臟病變方面應用aFGF 具備潛在價值。然而鑒于在促有絲分裂方面的廣譜性特征，aFGF 促進正常細胞有序增殖的同時也誘導腫瘤細胞和腫瘤干細胞大量增殖。借助基因工程技術，MaFGF 是能夠消除aFGF 促分裂性能，同時將無促分裂能力留存下來的突變體[2]，發揮與aFGF 等效的心肌保護作用[3]，還可在一定程度上避免不良反應的發生。但MaFGF 分子量很大，穩定性較差，在體外存在極大氧化失活風險，全身給藥被快速滅活，因此半衰期短，生物利用率不高，同時不具備可控性、安全性與高效性的心肌靶向傳輸載體和技術，采取直接心肌注射MaFGF 法，在操作復雜性、有創性等方面有所不足，使得其臨床應用受限。

將超聲微泡當作造影劑對靶向組織實施超聲顯影，受到治療或診斷性超聲波能量刺激，超聲微泡爆破所致空化效應與機械作用可使暫時性開放小孔見于局部內皮細胞膜和毛細血管上[8-9]，經由此類小孔，藥物能夠向組織內轉移，實現靶向輸送藥物的目的。此次研究在配制SonoVue-MaFGF 基礎上，超聲能量作用下于心肌組織對SonoVue-MaFGF 施以靶向爆破處理，由此完成MaFGF 向心肌組織的輸送，并釋放效能。通過超聲心動圖檢測發現，HF 模型組LVESd、LVEDd 均較對照組顯著升高，而LVEF、LVFS 則明顯降低；接受了6 周MaFGF 靶向干預后，相比HF 模型組，MaFGF+UTMD 組LVFS、LVEF 明顯升高，LVESd、LVEDd 則明顯下降?？梢姲⒚顾氐男募《拘钥蓪е聦嶒瀯游镄那淮蠓鶖U張，明顯損傷左心室收縮功能，同時由UTMD 介導的MaFGF 對于心衰大鼠左心室收縮功能可發揮積極的保護效應。心肌組織SOD、MDA 水平測定結果顯示，MaFGF組與MaFGF+UTMD 組SOD 明顯升高，但MDA 明顯降低，證實MaFGF 干預可有效抵抗由阿霉素所致的氧化應激反應。線粒體是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要供體以及作用靶點[10]，相比其它器官，作為能量需求高的臟器，心臟線粒體數量與密度較高，所以更易受到阿霉素所致氧化應激反應的攻擊。透射電鏡結果顯示，相較于正常對照組大鼠，HF 模型組大鼠的心肌肌絲之間排列紊亂，同時線粒體排列紊亂，腫脹變形，周圍可見空泡形成，說明HF 模型組大鼠心臟結構明顯異常以及能量代謝紊亂，而分布紊亂與腫脹的線粒體經過MaFGF+UTMD干預，出現明顯好轉，與心肌SOD 與MDA 檢測結果相符，更加證實了MaFGF 使阿霉素所致氧化應激反應受抑的機制可能為抑制ROS 靶向刺激線粒體膜。經Masson 膠原染色發現，HF 模型組大鼠心肌間與血管附近含膠原纖維量大幅上升，可見阿霉素心肌毒性能夠導致心肌間質與血管周圍纖維化的發生，經過MaFGF+UTMD 干預，心肌膠原統計結果顯示，CVF 與PVCA/LA 明顯下降。

綜上所述，本研究證實阿霉素心肌毒性能夠明顯提高心肌氧化應激水平，使得心衰大鼠產生明顯心肌纖維化現象，而心肌纖維化可導致心室壁僵硬，順應性減弱，心室腔明顯擴大，由此導致心功能明顯減低。MaFGF 具備抗氧化應激功能[3，11]，攜載MaFGF 的超聲微泡與UTMD 技術聯合應用，能夠對阿霉素誘導的心肌損傷發揮積極的防治作用，對心衰大鼠左心室收縮功能具有保護作用，分析其機制可能與MaFGF 減輕ROS 損傷心肌線粒體膜程度，增強心肌抗氧化功能，使氧化應激反應受抑并抑制心肌纖維化相關。