小建中湯激活Keap1-Nrf2-ARE信號通路抗小鼠運動性疲勞的作用

郝佳夢 周慶瑩 陳章風 李予煊 閆曉博 郭軍鵬 劉宏巖

(1河北醫科大學，河北 石家莊 050017；2長春中醫藥大學)

疲勞是機體復雜的生理變化過程，其發生機制目前尚沒有統一的定論〔1，2〕。氧自由基-脂質過氧化學說認為：運動等應激過程可產生大量氧自由基，中等至高濃度的自由基堆積可導致細胞線粒體膜脂質過氧化并產生氧化應激反應，從而促使細胞凋亡甚至壞死〔3，4〕，導致疲勞無法緩解，同時還可加速機體衰老過程〔5〕。因此，清除自由基、抗脂質過氧化是抗疲勞且防止疾病發生的途徑之一。《金匱要略·血痹虛勞病》篇中“虛勞病”和現代醫學的“疲勞”概念有相似之處，小建中湯為其中治療勞力過度所致虛勞里急的代表方劑。該方調和陰陽，和里緩急，能夠治療陰液耗損過多所導致的虛勞里急證候，臨床治療疲勞病癥效果顯著〔6〕。本實驗探討小建中湯抗小鼠運動性疲勞功效及其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雄性昆明小鼠60只，體重(20±2)g，由長春市易思實驗動物技術有限責任公司提供，許可證號：SCXK(吉)2016-0003，適應性飼養3 d。

1.2藥物與試劑 小建中湯：桂枝、白芍、炙甘草、生姜、大棗、飴糖。按人∶小鼠=1∶10換算小鼠用藥量。上方定為中劑量組，將劑量的三分之一和三倍作為低劑量和高劑量組，各組給藥量分別為0.58、1.75、5.25 mg/kg。煎煮時將除飴糖外藥材以8倍體積水浸泡0.5 h，文火0.5 h，后納膠飴，取液備用；二煎以6倍體積水，兩次煎液合并后濃縮。四君子湯：人參、白術、茯苓、甘草，煎煮方法同上。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)(20170720G)、超氧化物歧化酶(SOD)(20170612)、丙二醛(MDA)(20170610)試劑盒購自北京華英生物工程研究所；一抗GAPDH、Keap1、轉錄因子-E2相關因子(Nrf)2、二抗辣根過氧化物酶(HRP)購于Proteintech公司。

1.3儀器 M200PRO型酶標儀(TECAN公司中國)，Omega Lum G型化學發光凝膠成像儀(Aplegen公司)。

1.4負重游泳篩選 小鼠負重游泳，選取出現力竭狀態時間相近的48只小鼠。力竭標準：小鼠在水中旋轉，動作的協調性顯著降低，身體不能維持在水平面反復浮沉，至再次浮出水面的時間超10 s，被提起后無反抗掙扎。

1.5分組及給藥 將小鼠隨機分為正常組(C)、模型(M)組、小建中湯低劑量(SL)組、小建中湯中劑量(SM)組、小建中湯高劑量(SH)組、四君子湯(JZ)組，每組8只。C和M組按200 mg/(kg·d)給予生理鹽水，中藥各組按相應比例灌服小建中湯和四君子湯，給藥1 h后力竭游泳訓練，連續10 d。

1.6樣本采集及檢測 記錄每次力竭游泳時間。第10天游泳后，取雙側股四頭肌凍存備用。取骨骼肌100 mg，研磨，3 500 r/min離心15 min，取上清液，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測GSH-Px、SOD、MDA含量。

1.7Western印跡實驗方法 取肌肉組織50 mg，加入1 ml放射免疫沉淀(RIPA)裂解液研磨組織，冰上裂解30 min，隨后4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清備用。配置凝膠，進行垂直電泳，轉膜120 min。放入5%脫脂奶粉封閉60 min，加入一抗，4℃過夜，二抗孵育60 min。采用電化學發光(ECL)法進行蛋白顯色，用Gelpro32軟件對顯色條帶灰度值進行定量分析，以目的蛋白和內參蛋白灰度比值作為統計結果。

1.8統計方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組游泳時間 與M組〔(150±7.09)s〕相比，SL、SM、SH、JZ組均可顯著延長小鼠力竭游泳時間〔(217±11.90)、(193±13.12)、(217±17.77)、(184.27±15.24)s，P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.05〕。

2.2各組股四頭肌GSH-Px、SOD、MDA水平 與C組比較，M組GSH-Px、SOD含量顯著下降(P<0.01，P<0.05)，MDA含量顯著增多(P<0.05)。與M組相比，GSH-PX、SOD含量以SL、SH組、JZ組變化顯著(P<0.01)；MDA含量以SL、SM、SH組變化顯著(P<0.01，P<0.01,P<0.05)，JZ組未見顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組GSH-Px、SOD、MDA水平

與C組相比，1)P<0.05，2)P<0.01；與M組相比，3)P<0.05，4)P<0.01

2.3各組股四頭肌Keap1和Nrf2蛋白表達 與C組(1.00±0.03)相比，M組Keap1蛋白表達(1.12±0.02)顯著上升(P<0.05)。與M組相比，SL、SH和JZ組Keap1蛋白(0.97±0.04、1.04±0.03、0.61±0.03)顯著降低(P<0.05)，SM組為(1.11±0.03)，無顯著差異(P>0.05)。在Nrf2蛋白表達方面， M組(0.38±0.06)較C組(1.18±0.08)明顯下降(P<0.01)；與M組相比，SL、SM、SH組Nrf2蛋白表達量(1.00±0.01、0.68±0.02、0.77±0.03)均明顯提高(均P<0.05)，JZ組(0.40±0.06)無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組股四頭肌Keap1和Nrf2表達

3 討 論

疲勞屬于中醫的虛勞病。《金匱要略》中的虛勞病篇以桂枝湯加減的湯劑——小建中湯、黃芪建中湯、桂枝加龍骨牡蠣湯作為抗疲勞的方劑。虛勞病的病因為勞傷過度〔7〕，繼而耗傷人體的氣血陰陽，結果導致陰陽失和、氣血失常而疲勞。因此認為，虛勞病的病機乃是陰陽失和、氣急逆亂，并非臟腑虧虛、陰陽不足〔8〕。基于此，仲景治療虛勞是采用調和營衛的方法，通過調和營衛來調和逆亂的氣血陰陽。小建中湯為虛勞病中治療勞力過度所致虛勞里急的代表方劑，湯證所列癥狀包括“悸，衄，腹中痛，夢失精，四肢痠疼，手足煩熱，咽干口燥”，與急性勞傷所致的疲勞狀態較為相似，基本病機是由于急性勞傷而汗液大出，造成衛陽之氣被郁、營陰津液不斂，從而形成機體陰陽失和、氣機逆亂的證候。該方桂枝、白芍相配，一辛一酸、一陰一陽、一散一斂，使衛氣宣發、營陰內斂，芍藥加倍更增酸甘化陰、緩急止痛之功；生姜兼能發散，大棗補脾和胃；甘草、桂枝相合辛甘化陽以通衛，甘草、白芍相合酸甘化陰以和營；飴糖滋養陰液，以助汗源，諸藥合力平調陰陽，調和氣血。氣血和則生機有源，對于陰陽失調、氣血失和導致的虛勞里急病癥具有確切療效。

一些學者認為疲勞是“氣虛”證，所謂“少氣不足以息則倦怠無力”，并且“勞則氣耗，勞則喘息汗出”勞倦過度可以導致氣耗而虛，因而治療時常采用補氣健脾方來補虛抗勞。四君子湯作為補氣經典方劑，在研究中顯示其能夠減少力竭小鼠運動后血清乳酸含量、提升肝糖原、肌糖原含量，改善免疫器官臟器指數〔9，10〕，具有提高機體運動能力的作用。

目前對于Keap1-Nrf2-ARE信號通路的研究十分廣泛〔11，12〕。生理狀態下，Nrf2主要與Keap1結合，經泛素化作用分解，以保持在生理狀態下的低轉錄活性〔13〕。當細胞受到氧自由基(ROS)或其他親核基團刺激后，Nrf2與 Keap1解耦聯，活化的 Nrf2轉運進入細胞核，與抗氧化反應元件(ARE)相結合，下游Ⅱ相代謝酶和抗氧化酶SOD、GST-Px等的表達被激活，調節體內氧化平衡，有效清除自由基和其他氧化代謝產物〔14，15〕，發揮抗氧化損傷作用〔16〕，保護機體組織細胞的正常功能。研究表明，急性運動后Nrf2基因敲除小鼠的抗氧化蛋白酶含量明顯低于正常組〔17〕；一次大強度力竭運動可提高小鼠Nrf2基因轉錄〔14〕。

本實驗表明機體脂質過氧化產物增多，且抗氧化能力明顯不足；氧化應激狀態下Keap1與Nrf2解離，Nrf2核轉位參與抗氧化功能。長時間力竭運動后機體疲勞未恢復，抗氧化能力下降，導致Nrf2表達量下降，Nrf2不能更好地啟動下游抗氧化酶GSH-Px、SOD的生成，機體抗氧化能力不足，無法有效清除氧化代謝產物，疲勞狀態持續存在。本文結果提示小建中湯可以通過提高Nrf2表達，增強下游抗氧化蛋白酶GSH-Px、SOD的活性，逆轉力竭大鼠氧化應激損傷。由此可見，小建中湯通過調節Keap1-Nrf2-ARE信號傳導通路提高GSH-Px、SOD抗氧水平而發揮抗疲勞的作用。