早期恐懼聲音應(yīng)激對大鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力及海馬CA1區(qū)5-HT1AR-CREB-BDNF信號通路的影響

孫縵利 鄧海峰 王興紅

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 漯河 462000)

心理應(yīng)激是機(jī)體在某種環(huán)境刺激作用下由于客觀要求和應(yīng)付能力不平衡而發(fā)生的心理生理功能改變的過程。心理應(yīng)激的產(chǎn)生可提高機(jī)體的警覺水平，應(yīng)付各種環(huán)境變化的挑戰(zhàn)，但長時(shí)間的應(yīng)激狀態(tài)則會(huì)損害心身健康〔1〕，兒童的心理狀態(tài)處于不穩(wěn)定的易變期，早期創(chuàng)傷性心理應(yīng)激事件(如母愛剝奪、家庭變異、受虐、恐怖影像、自然災(zāi)害等)對成年后的認(rèn)知能力、學(xué)習(xí)記憶、精神狀態(tài)等往往有較深遠(yuǎn)的影響〔2〕。更好地了解童年期心理創(chuàng)傷及創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的相關(guān)問題，有助于進(jìn)一步認(rèn)識心理創(chuàng)傷帶來的影響，理智對待創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙。研究報(bào)道，心理應(yīng)激能夠損傷動(dòng)物空間學(xué)習(xí)和記憶能力〔3〕；另有研究表明，5-羥色胺1A受體(HT1AR)-環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)-腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)信號通路和動(dòng)物的認(rèn)知情況密切相關(guān)〔4〕。本研究擬探討嬰幼兒期心理應(yīng)激與成年后學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系及其相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 兔抗鼠5-HT1AR、CREB和BDNF多克隆抗體均購自Abcam公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)公司；Morris水迷宮裝置由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 10只健康SD孕鼠，清潔級，體質(zhì)量(230±10)g，購于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證編號：SCXK豫 2014-0002)，所有動(dòng)物在自然光暗周期的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由覓食、飲水。10只孕鼠隨機(jī)分為對照組和應(yīng)激組各5只，待其生產(chǎn)后每組各選擇20只雄性仔鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。參照Hu等〔5〕的方法，應(yīng)激組的雄性仔鼠于出生后第1天開始接受恐懼聲音應(yīng)激，強(qiáng)度為65～85 dB，每天上、下午各播放2 h，應(yīng)激后放回原籠置于正常環(huán)境下飼養(yǎng)，應(yīng)激持續(xù)21 d。對照組雄性仔鼠出生后于正常環(huán)境下飼養(yǎng)。兩組仔鼠均于出生后第21天斷乳，然后自由進(jìn)食、飲水。應(yīng)激結(jié)束后5 w行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測學(xué)習(xí)記憶能力。

1.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測學(xué)習(xí)記憶能力 Morris水迷宮水池中加入適量的墨汁，使水池成為不透明色(去除視覺干擾)。在圓桶的上緣等距離地設(shè)東、南、西、北4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)作為進(jìn)水點(diǎn)，以這4個(gè)入水點(diǎn)在水面和水桶底部的投影點(diǎn)將水面和水桶部分均等地分為4個(gè)象限。將平臺放置于第3象限的中間，水溫保持在22～23℃。

1.3.1大鼠訓(xùn)練 訓(xùn)練時(shí)，將大鼠面向池壁從4個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池，記錄從入水到找到水下隱蔽平臺并站立于其上所需時(shí)間，作為潛伏期。找到平臺后，讓其在平臺上站立60 s。若入水后120 s未能找到平臺，則將其輕輕從水中拖上平臺，并停留10 s，然后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。每只大鼠從4個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池為一次訓(xùn)練，兩次訓(xùn)練之間間隔30 s，用紙巾將其擦干凈。

1.3.2定位航行試驗(yàn) 觀察和記錄大鼠尋找并爬上平臺的路線圖及所需時(shí)間，即記錄其潛伏期，歷時(shí)4 d，上下午各訓(xùn)練4次(各個(gè)象限)，記錄其潛伏期，上臺后休息60 s，繼續(xù)下一個(gè)象限訓(xùn)練。用于測量對水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的獲取能力。

1.3.3空間搜索試驗(yàn) 定位航行試驗(yàn)結(jié)束后去除平臺，從同一個(gè)入水點(diǎn)放入水中，測其第一次到達(dá)原平臺位置的時(shí)間、120 s內(nèi)穿環(huán)次數(shù)。用于測量學(xué)會(huì)尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的保持能力。

1.4HE染色觀察海馬CA1區(qū)的病理情況 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取4只大鼠，0.8%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，0.9%生理鹽水做心臟灌流5 min，然后4%多聚甲醛灌流固定約10 min，斷頭取出腦組織，4%多聚甲醛中室溫固定至少6 h，酒精梯度脫水(各10 min)，二甲苯透明和石蠟包埋，冠狀面切片，切片厚度為5 μm，烤片，貼片，HE染色2～3 min，酒精脫水，再經(jīng)二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.5免疫熒光組織化學(xué)法檢測海馬CA1區(qū)5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表達(dá) 每組各取8只大鼠，0.8%戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)4%多聚甲醛心臟灌流，用徠卡冰凍切片機(jī)對灌流固定好的組織進(jìn)行冠狀面切片，厚度為30 μm。所得切片置于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min×3次。用0.3% Triton X-100破膜處理2 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，10%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，加入一抗(兔多克隆抗體5-HT1AR，1∶500；兔多克隆抗體CREB，1∶300；兔多克隆抗體BDNF，1∶500)4℃孵育48 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，用FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶1 000)孵育2 h，0.01 mol/L PBS 洗5 min×3次，90%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。每只大鼠隨機(jī)選取5張非連續(xù)切片，采用Image pro plus6.0圖像處理軟件測定其積分光密度值(IOD)。

1.6Western印跡法檢測海馬5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表達(dá) 每組各取8只，0.8%戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)4%多聚甲醛心臟灌流，快速取出全腦，冰浴分離出海馬，按1 g∶10 ml的比例加入全細(xì)胞裂解液，組織經(jīng)勻漿、超聲破碎后，用二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)硝酸纖維素(NC)膜，10%脫脂牛奶封閉NC膜1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，然后室溫下與兔抗鼠一抗5-HT1AR(1∶1 000)、CREB(1∶1 000)、BDNF(1∶1 000)雜交反應(yīng)2 h，TBST漂洗同前，再將NC膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG(1∶3 000)雜交反應(yīng)1 h，TBST漂洗同前，加入電化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)5 min，保鮮膜包裹，暗室進(jìn)行X線膠片曝光、顯影和定影。然后同一張NC膜再與β-肌動(dòng)蛋白(actin)(1∶1 000)進(jìn)行雜交反應(yīng)。Western印跡條帶經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描處理，計(jì)算單位光密度值和條帶面積，將各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的總光密度值與對照組比較，得到相對百分?jǐn)?shù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1學(xué)習(xí)記憶能力檢測結(jié)果 與對照組相比，應(yīng)激組大鼠逃避潛伏期和第1次到達(dá)原平臺位置的時(shí)間明顯延長(P<0.001)，穿環(huán)次數(shù)明顯減少(P<0.001)。見表1。

2.2海馬CA1區(qū)HE染色結(jié)果 對照組海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)整齊、排列緊密，而應(yīng)激組海馬區(qū)的神經(jīng)元排列疏松紊亂，并且出現(xiàn)了神經(jīng)元丟失。見圖1。

2.3兩組海馬CA1區(qū)5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表達(dá)比較 被標(biāo)記上綠色或黃色的為陽性細(xì)胞。

免疫熒光組化結(jié)果表明，對照組海馬CA1區(qū)5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白陽性表達(dá)較多，染色較強(qiáng)，而應(yīng)激組海馬CA1區(qū)5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白陽性表達(dá)明顯減少(P<0.001)，染色較弱。見圖2，表2。與對照組相比，應(yīng)激組海馬CA1區(qū)的5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.001)，見表2，圖3。

表1 各組水迷宮、跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

圖1 兩組海馬CA1區(qū)的形態(tài)(HE染色，×400)

圖2 兩組海馬CA1區(qū)5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表達(dá)(HE染色，×400)

組別免疫熒光組織化學(xué)(IOD)5-HT1ARCREBBDNFWestern印跡5-HT1AR/β-actinCREB/β-actinBDNF/β-actin對照組0.62±0.030.43±0.020.75±0.050.99±0.221.08±0.260.93±0.20應(yīng)激組0.47±0.020.28±0.010.61±0.030.42±0.150.31±0.130.40±0.14t/P值11.770/<0.00118.970/<0.0016.791/<0.0016.119/<0.0017.492/<0.0016.140/<0.001

圖3 兩組海馬5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白的表達(dá)

3 討 論

心理應(yīng)激動(dòng)物模型的造模方法常見的有足底電機(jī)、睡眠剝奪、強(qiáng)迫游泳等，但這些造模方法大都包括軀體應(yīng)激和心理應(yīng)激兩種影響因素。以大鼠恐懼的聲音為應(yīng)激源對其持續(xù)應(yīng)激所建立的恐懼聲音應(yīng)激模型是一種簡單易行、較為純粹的心理應(yīng)激模型。Morris水迷宮是檢測動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的一種經(jīng)典方法，而對學(xué)習(xí)記憶能力的檢測是對心理應(yīng)激水平評估的一項(xiàng)重要指標(biāo)〔6〕。嬰幼兒期是神經(jīng)發(fā)育最迅速的時(shí)期，此時(shí)各種應(yīng)激極易導(dǎo)致神經(jīng)可塑性變化，從而影響后期的認(rèn)知發(fā)展和運(yùn)動(dòng)功能〔7〕。本研究結(jié)果顯示，早期恐懼聲音應(yīng)激可以降低其成年后的學(xué)習(xí)記憶能力，這與之前報(bào)道一致〔8〕。提示對恐懼聲音應(yīng)激模型的處理是成功的。

海馬是學(xué)習(xí)記憶發(fā)生、改變的關(guān)鍵腦區(qū)，應(yīng)激時(shí)海馬尤其是CA1區(qū)結(jié)構(gòu)極易受損而發(fā)生可塑性變化，從而影響學(xué)習(xí)記憶功能〔9〕。本實(shí)驗(yàn)表明早期恐懼聲音應(yīng)激可以導(dǎo)致海馬CA1區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生病理學(xué)改變。5-HT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)的遞質(zhì)，其作用是通過5-HT受體中介〔10〕，可以調(diào)節(jié)突觸遞質(zhì)釋放、改變突觸傳遞效率、調(diào)控神經(jīng)損傷后修復(fù)能力。5-HT受體有很多亞型，其中5-HT1AR集中于大腦皮質(zhì)及邊緣葉等與記憶功能密切相關(guān)的腦區(qū)，其活性與人類的認(rèn)知功能息息相關(guān)，是介導(dǎo)5-HT系統(tǒng)發(fā)揮其調(diào)控神經(jīng)功能的重要受體〔11〕。研究報(bào)道，增強(qiáng)海馬5-HT1AR介導(dǎo)的神經(jīng)信息傳遞，可提高海馬功能和抵御應(yīng)激性損傷的能力〔12〕。由此分析早期恐懼聲音應(yīng)激導(dǎo)致的海馬CA1區(qū)病理學(xué)改變可能和5-HT1AR活性有關(guān)。5-HT1AR并非直接影響學(xué)習(xí)記憶能力，其表達(dá)發(fā)生變化后，引起下游分子發(fā)生相應(yīng)變化，才能進(jìn)一步影響突觸可塑性，最終影響學(xué)習(xí)記憶〔13〕。

CREB是一種重要的參與學(xué)習(xí)記憶功能的核轉(zhuǎn)錄因子，也是5-HT1AR介導(dǎo)的信號通路下游的重要分子之一〔14〕。5-HT1AR通過G蛋白耦聯(lián)調(diào)控cAMP酶活性，進(jìn)而調(diào)控CREB活性。CREB活性受到抑制后會(huì)引發(fā)中樞內(nèi)多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)下降，從而降低突觸可塑性、抑制長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)〔15〕。本研究提示CREB表達(dá)下調(diào)可能參與了早期恐懼聲音應(yīng)激導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力降低。

BDNF是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，廣泛地表達(dá)于大腦皮層、海馬、下丘腦等中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與神經(jīng)元的分化、發(fā)育和神經(jīng)元損傷后的修復(fù)與再生，同時(shí)其表達(dá)下調(diào)可降低突觸傳遞效率和突觸可塑性〔16〕。本實(shí)驗(yàn)提示BDNF表達(dá)下調(diào)可能參與了早期恐懼聲音應(yīng)激導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力降低。

基于以上研究報(bào)道和本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析早期恐懼聲音應(yīng)激導(dǎo)致大鼠成年后的學(xué)習(xí)記憶能力下降可能和海馬CA1區(qū)5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表達(dá)變化有關(guān)，其機(jī)制可能是早期恐懼聲音應(yīng)激首先導(dǎo)致海馬CA1區(qū)5-HT1AR表達(dá)下降，進(jìn)而通過抑制cAMP酶活性下調(diào)CREB表達(dá)，CREB表達(dá)下調(diào)進(jìn)一步使BDNF表達(dá)降低，由于BDNF表達(dá)降低可導(dǎo)致突觸傳遞效率下降，產(chǎn)生長時(shí)程抑制效應(yīng)，最終引發(fā)學(xué)習(xí)記憶障礙，但具體機(jī)制還需深入探究。

綜上，早期恐懼聲音應(yīng)激可能通過下調(diào)5-HT1AR-CREB-BDNF信號通路，使大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。即嬰幼兒期遭受過度心理應(yīng)激可影響成年后的認(rèn)知能力，因此為了保護(hù)嬰幼兒健康身心發(fā)展，除了采取措施避免其遭受過度應(yīng)激外，還要在其遭受應(yīng)激后盡早采取措施以預(yù)防更嚴(yán)重的后果出現(xiàn)。