LanCL1過表達對氧糖剝奪誘導PC12細胞凋亡及Sirt3-PGC-1α通路的影響

王御林 高元杰 鐘純正 王生成 王曉峰

(儋州市人民醫院 1神經內科，海南 儋州 571700；2呼吸內科)

缺氧缺血性腦血管疾病占全部腦血管疾病的50%以上，腦部缺血缺氧易造成神經功能損傷引發腦卒中，是導致患者死亡和神經系統后遺癥的主要原因之一〔1〕。目前缺血性腦損傷的病理機制尚不完全清除，已證實神經細胞凋亡是缺血性腦損傷的主要表現形式，對腦損傷范圍及患者神經功能預后起決定性作用〔2,3〕。因此，研究神經細胞凋亡機制對臨床治療腦缺血性疾病具有重要意義。研究表明，人源硫化雙丙氨酸環化酶樣蛋白(LanCL)1在腦神經元中表達，受神經元活動誘導，是響應氧化應激并減輕神經元損傷所必需的元素，對神經細胞具有保護作用〔4〕。本研究以神經細胞株PC12細胞為研究對象，模擬氧糖剝奪(OGD)模式，分析OGD條件下PC12細胞中LanCL1的表達變化，探討過表達LanCL1對PC12凋亡的影響及其保護神經細胞的可能作用途徑。

1 材料與方法

1.1材料 PC12未分化細胞購于豐暉生物，DMEM培養基、胎牛血清、馬血清和青霉素、鏈霉素購于美國Hyclone公司，磷脂結合蛋白(Annexin)V/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購于上海貝博生物，pcDNA3.1載體及pcDNA3.1-LanCL1合成于武漢伯遠生物科技有限公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司，Lipofectamine2000轉染試劑盒和Trizol試劑購于美國Invitrogen公司，互補脫氧核糖核酸(cDNA)合成試劑盒和實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒購于美國Sigma公司，放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液購于北京索萊寶科技有限公司，沉默調節蛋白(Sirt)3抗體一抗、過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子(PGC)-1α抗體一抗、LanCL1抗體、辣根過氧化物標記的羊抗兔二抗購于武漢艾美捷科技有限公司。FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)，VeritiTMPCR儀(美國Thermo Scientific公司)，7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，二氧化碳(CO2)培養箱(德國Binder公司)，Multiskan Sky全波長酶標儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.2細胞培養 將PC12細胞置于含有5%胎牛血清、10%馬血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養基中，放于5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養。2 d后進行傳代，取細胞密度5×105個/ml接種，每2～3 d換液一次，待細胞密度至(2～4)×106個/ml時進行第2次傳代。使用神經生長因子(NGF)50 ng/ml處理第2代對數生長期細胞，促進細胞分化。

1.3細胞分組 將細胞分為4組，對照組為正常培養的PC12細胞；OGD組將PC12細胞接種于無血清DMEM培養基，置于5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養6～8 h后，轉入加血清培養基中繼續培養；pcDNA3.1組為將pcDNA3.1空載體轉染至PC12細胞(轉染方法參照試劑盒說明書進行)，并將細胞接種于無血清DMEM培養基，置于5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養6～8 h后，轉入加血清培養基中繼續培養；pcLanCL1組為將pcDNA3.1-LanCL1轉染至PC12細胞，并將細胞接種于無血清DMEM培養基，置于5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養6～8 h后，轉入加血清培養基中繼續培養。

1.4RT-PCR檢測LanCL1 mRNA表達 采用Trizol試劑分別提取對照組和OGD組培養6 h、12 h、24 h、48 h細胞總RNA，使用cDNA合成試劑盒合成cDNA，稀釋cDNA為統一濃度，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，RT-PCR檢測LanCL1 mRNA相對表達量，RT-PCR體系參照定量RT-PCR試劑盒，模板量為1 μl，程序：95℃ 2 min；95℃ 1 min；55℃ 2 min，共40個循環。LanCL1引物序列：正向5′-CCTTCAGGTGAACCAAGGAA-3′，反向5′-AGATCACGTCAGCACACTGC-3′；GAPDH引物序列：正向5′-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3′，反向5′-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3′。同時檢測pcDNA3.1組和pcLanCL1組細胞培養24 h時LanCL1 mRNA相對表達量，相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

1.5MTT實驗檢測細胞生存率 收集各組細胞，以1×104個/孔接種于96孔板，按每組的培養條件繼續培養24 h后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，避光培養4 h。倒掉培養基，每孔加入200 μl DMSO，震蕩混勻1 min，在酶標儀上測定570 nm處吸光度。

1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集各組細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗1次，離心棄PBS后，加入PBS重懸細胞，過濾，棄PBS。加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的Annexin V和PI染色液，避光染色30 min，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況。

1.7Western印跡檢測LanCL1、Sirt3和PGC-1α蛋白表達 收集1.3中各組培養6、12、24、48 h后的細胞，使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目的條帶后，轉至纖維素膜(轉膜過程中帶上干凈的無菌手套，避免污染及損壞薄膜)，封閉2 h后，分別加入稀釋過的LanCL1抗體、Sirt3抗體和PGC-1α抗體一抗，4℃過夜孵育，然后加入稀釋的辣根過氧化物標記的羊抗兔二抗，繼續孵育2 h，抗體稀釋比例參照說明書。加入顯色劑顯色后，放入Kodak數字成像系統進行掃描，并采用Image J軟件分析目的條帶灰度值，以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達量。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行χ2檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1LanCL1在OGD PC12細胞中表達降低 與對照組PC12細胞相比，OGD組PC12細胞中LanCL1 mRNA和蛋白表達量均顯著低于對照組(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 兩組各時間點PC12細胞中LanCL1 mRNA及蛋白的表達水平

與對照組比較，1)P<0.05

圖1 兩組PC12細胞中LanCL1蛋白表達

2.2LanCL1過表達促進OGD PC12細胞存活 對照組、OGD組、pcDNA3.1組和pcLanCL1組LanCL1 mRNA相對表達量分別是1.86±0.41、0.79±0.24、0.70±0.17、1.81±0.39，pcLanCL1組細胞中LanCL1 mRNA相對表達量顯著高于OGD組和pcDNA3.1組(P<0.05)，說明細胞轉染實驗成功。OGD組和pcDNA3.1組細胞存活率〔(45.38±9.42)%、(44.46±10.83)%〕顯著低于對照組〔(95.67±17.23)%，P<0.05〕；pcLanCL1組細胞存活率〔(88.94±15.27)%〕較OGD組和pcDNA3.1組顯著升高(P<0.05)，與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，說明過表達LanCL1促進OGD條件下PC12細胞生存。

2.3LanCL1過表達抑制OGD誘導的PC12細胞凋亡 OGD組、pcDNA3.1組和pcLanCL1組細胞凋亡率〔(46.83±10.74)%、(45.33±9.86)%、(21.19±3.68)%〕均顯著高于對照組〔(13.37±2.51)%,P<0.05〕，pcDNA3.1組細胞凋亡率與OGD組比較差異無統計學意義(P>0.05)，pcLanCL1組細胞凋亡率顯著低于OGD組(P<0.05)，說明LanCL1過表達抑制OGD誘導的PC12細胞凋亡。見圖2。

圖2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡

2.4LanCL1過表達促進OGD PC12細胞中Sirt3、PGC-1α蛋白表達 OGD組和pcDNA3.1組細胞中Sirt3、PGC-1α蛋白相對表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)，均顯著低于對照組(P<0.05)；pcLanCL1組細胞中Sirt3、PGC-1α蛋白相對表達量均顯著高于OGD組和pcDNA3.1組(P<0.05)，與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。說明LanCL1過表達能夠促進OGD PC12細胞中Sirt3、PGC-1α蛋白表達。見圖3，表2。

1～4：對照組、OGD組、pcDNA3.1組、pcLanCL1組圖3 各組細胞中Sirt3、PGC-1α蛋白表達水平

組別Sirt3PGC-1α對照組1.24±0.391.19±0.28OGD組0.62±0.251)2)0.61±0.231)2)pcDNA3.1組0.61±0.221)2)0.59±0.181)2)pcLanCL1組1.08±0.351.03±0.32

與對照組比較：1)P<0.05；與pcLanCL1組比較，2)P<0.05

3 討 論

近年來，雖然腦缺血缺氧引起的腦卒中死亡率有所下降，但腦卒中仍是全球人類死亡和殘疾的主要原因〔5〕。目前，組織型纖溶酶原激活劑是唯一獲得食品藥品監督管理局批準的用于治療急性缺血性腦卒中的治療藥物，因此神經保護藥物的研發和應用對腦卒中患者具有重要意義。LanCL1是LanC樣蛋白家族成員，以往研究證實LanCL1能特異性結合還原型谷胱甘肽(GSH)，參與氧化還原調節〔6〕。近年來動物模型實驗表明，LanCL1蛋白在腦、脊髓中高表達，表現出受神經元活動調節，并且在神經元抗氧化活性中起關鍵作用〔7〕。本研究說明LanCL1在神經細胞損傷保護中起作用。此外，本研究還通過檢測Sirt3-PGC-1α通路闡述了LanCL1保護神經細胞的可能潛在機制。

Sirt3是NAD+依賴性蛋白質脫乙酰酶，主要定位在線粒體，是線粒體功能調節因子，在抗細胞凋亡和抗氧化應激中發揮重要作用〔8,9〕。研究報道，Sirt3在衰老、神經退行性疾病和抗逆性中可以預防神經紊亂，起到神經保護作用，且Sirt3的激活可以介導各種保護劑對腦卒中的有益作用〔10,11〕。本研究與Xie等〔12〕研究結果相似。Sirt3抑制細胞凋亡的作用主要有：①可直接調節線粒體通透性轉換孔關閉，抑制促凋亡蛋白釋放而降低細胞凋亡率〔13〕；②Sirt3也可通過清除氧自由基抑制氧化應激引起的細胞凋亡〔14〕；③通過抑制c-Jun氨基末端激酶的磷酸化或通過去乙酰化P53激活抗凋亡途徑而抑制細胞凋亡〔15〕。提示過表達LanCL1可能通過誘導Sirt3表達升高降低OGD誘導的PC12細胞死亡。

PGC-1α是一種轉錄共激活因子，在調節大腦等線粒體生物合成和能量代謝中起關鍵作用〔16,17〕。Wang等〔18〕研究表明，敲除Sirt3加劇OGD誘導的PC12細胞損傷，而過表達Sirt3可以保護OGD誘導的PC12細胞死亡，其保護作用依賴于PGC-1α和錳超氧化物歧化酶。研究報道，PGC-1α-Sirt3途徑可通過直接去乙酰化和三磷酸腺苷(ATP)中的ATP合酶β來預防神經元細胞凋亡〔19,20〕。本研究提示LanCL1對保護OGD誘導的PC12細胞的保護作用可能與PGC-1α-Sirt3途徑密切相關，過表達LanCL1能夠通過Sirt3-PGC-1α信號途徑保護OGD誘導的PC12細胞凋亡。

本研究初步分析LanCL1在OGD條件下PC12細胞中的表達作用及其可能作用機制，后期將會繼續驗證其神經元保護作用，為臨床治療腦缺血缺氧性疾病提供理論參考和新的治療靶點。