miR-509-3p靶向BCL2基因調控乳腺癌細胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的分子機制

秦少杰 劉清媛 唐振寧 劉奇?zhèn)?

(寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院腫瘤外三科，寧夏 銀川 750004)

乳腺癌是臨床常見惡性腫瘤，目前乳腺癌發(fā)病率及死亡率逐年升高，已嚴重威脅人類生命安全，由于內(nèi)分泌系統(tǒng)較為復雜導致乳腺癌早期診斷較為困難，近年來乳腺癌患者預后明顯改善，但患者5年生存率仍較低，而術后乳腺癌細胞惡性增殖、遷移及侵襲是患者發(fā)生遠處轉移的重要原因〔1〕。因而深入探究乳腺癌發(fā)生轉移的機制，積極尋找乳腺癌靶向治療的靶點基因十分重要。微小RNA(miRNA)可通過靶向調控下游靶基因表達進而調控機體細胞各種生理病理過程，研究表明miRNA表達異常可參與多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔2〕。miR-509-3p在頭頸鱗狀細胞癌細胞系中表達量明顯下調，上調miR-509-3p表達可通過調控表皮生長因子受體(EGFR)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶向基因(MTOR)信號通路進而抑制細胞增殖〔3〕。miR-509-3p在肝癌組織中的表達低于癌旁組織，上調miR-509-3p表達可抑制肝癌細胞增殖及侵襲能力〔4〕。miR-509-3p通過下調X連鎖凋亡抑制劑而抑制膠質瘤細胞增殖及侵襲〔5〕。但miR-509-3p在乳腺癌致病機制中的研究尚未見報道。長鏈非編碼RNA CASC2可通過沉默B淋巴細胞瘤(BCL)2而增強小檗堿誘導的結腸直腸癌細胞凋亡能力〔6〕。人參皂苷-Rg5通過抑制BCL2表達進而抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤增殖并誘導細胞凋亡〔7〕。starBase靶基因預測出BCL2基因可能是miR-509-3p的靶基因，由此推測miR-509-3p是否可通過靶向調控BCL2基因表達而影響乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡。因此，本研究主要驗證上述推測，為揭示乳腺癌發(fā)生轉移機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集2016年2月至2017年3月于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院就診的乳腺癌患者65例為研究對象，患者均經(jīng)手術病理證實為乳腺癌，年齡為50～70歲，平均為(65.32±7.16)歲，納入標準：生存時間超過6個月；術前未接受化療或放療等治療；臨床資料完整者。排除標準：合并其他惡性腫瘤者；心肌梗死等心血管疾病病史者；依從性較差者。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者及其家屬知情且簽署同意書。患者均于術中切除乳腺癌組織及癌旁組織并迅速放入液氮中，術后將其轉移至-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2材料與試劑 乳腺上皮細胞MCF-10A與乳腺癌細胞MCF-7、T47D、MDA-MB-231、MDAMB-453、Hs578均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清與胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；miR-509-3p模擬物(mimics)、陰性對照miR-NC均購自Dharmacon公司(上海睿鉑賽生物科技有限公司代理)；Lipofectamine2000與Trizol試劑均購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；Transwell小室購自美國Corning公司；噻唑藍(MTT)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Mgteigel基質膠購自美國BD公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；Trizol、反轉錄及qRT-PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司。

1.3方法

1.3.1細胞轉染及分組 取對數(shù)生長期乳腺癌MDA-MB-231細胞，放入不含血清及青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，待細胞融合度達到50%時進行轉染，嚴格按照Lipofectamine2000轉染試劑盒說明書進行操作，將miR-509-3p mimics、miR-NC、anti-miR-509-3p、anti-miR-NC分別轉染至乳腺癌MDA-MB-231細胞，分別為miR-509-3p組、miR-NC組、anti-miR-509-3p組、anti-miR-NC組，同時將pcDNA-BCL2與miR-509-3p mimics共轉染至乳腺癌MDA-MB-231細胞，miR-509-3p mimics與pcDNA-BCL2共轉染至乳腺癌MDA-MB-231細胞，分別為miR-509-3p+pcDNA-BCL2組、miR-509-3p+pcDNA組，轉染6 h后更換培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.2qRT-PCR檢測細胞中miR-509-3p、BCL2 mRNA表達水平 收集乳腺癌組織及癌旁組織，液氮迅速研磨，加入1 ml Trizol試劑，按照 Trizol法提取組織RNA，(收集各組細胞采用Trizol法提取細胞總RNA)，按照反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書配置qRT-PCR反應體系，反應條件：95℃ 2 min循環(huán)1次，(95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s)循環(huán)40次，采用2-ΔΔCt法計算miR-509-3p、BCL2 mRNA相對表達量。

1.3.3MTT檢測細胞增殖 收集對數(shù)生長期乳腺癌MDA-MB-231細胞，調整細胞濃度5×104個/ml接種于96孔板(1×104個細胞/孔)，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每孔分別加入20 μl MTT溶液(質量分數(shù)5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl/孔，低速振蕩10 min，分別于溶解后的24 h、48 h、72 h時置于酶標儀檢測490 nm處各孔吸光度值(OD)。實驗均設置3次重復。

1.3.4流式細胞術檢測細胞凋亡 用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌各組對數(shù)生長期乳腺癌MDA-MB-231細胞，低溫條件下1 000 r/min轉速離心5 min(離心半徑6 cm)，PBS洗滌，再次離心，棄上清，分別加入5 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC與碘化丙啶(PI)，充分混勻后室溫避孵育20 min，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.5Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲 取100 μl基質膠稀釋液(無血清DMEM培養(yǎng)基：基質膠=1∶8)鋪于Transwell小室上室，500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入Transwell小室的下室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，擦去未侵入細胞表面的細胞，多聚甲醛固定20 min，結晶紫(0.1%)染色10 min，干燥，顯微鏡下拍照并計算侵襲細胞數(shù)。細胞遷移實驗：取100 μl不含血清的DMEM培養(yǎng)基放入Transwell小室的上室，另取500 μl含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基加入Transwell小室的下室，其余步驟同細胞侵襲實驗，顯微鏡下觀察遷移細胞數(shù)。實驗設置3次重復，每組實驗均設置3個復孔。

1.3.6Western印跡檢測細胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、p21、BCL2蛋白表達 收集各組乳腺癌MDA-MB-231細胞，加入蛋白裂解液〔1 ml RIPA、1% 苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.1% 抑肽酶〕，冰上裂解30 min提取細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白，取20 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)反應，蛋白凝膠轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗(稀釋比1∶1 000)4℃條件下孵育24 h，TBST洗膜3次，每次5 min，室溫條件下孵育二抗(稀釋比1∶5 000)，孵育時間1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，滴加電化學發(fā)光(ECL)劑，用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3.7雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-509-3p、BCL2 的靶向關系 starBase預測miR-509-3p靶基因可能為BCL2，構建含有miR-509-3p與BCL2的結合位點的野生型載體BCL2-WT，構建含有miR-509-3p與BCL2突變結合位點的突變型載體BCL2-MUT，同時將乳腺癌MDA-MB-231細胞接種于24孔板，細胞匯合度達到80%轉染，共轉染分組依據(jù)：BCL2-WT與miR-509-3p mimics共轉染；BCL2-WT與miR-NC共轉染；BCL2-MUT與miR-509-3p mimics共轉染；BCL2-MUT與miR-NC共轉染，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別加入細胞裂解液(60 μl/孔)，低速振蕩20 min，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組細胞熒光素酶活性，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1乳腺癌組織及細胞系中miR-509-3p與BCL2的表達 與癌旁組織相比，乳腺癌組織中miR-509-3p表達水平顯著降低，而BCL2 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；相對于MCF-10A細胞，乳腺癌細胞MCF-7、T47D、MDA-MB-231、MDAMB-453、Hs578中miR-509-3p表達水平顯著降低(P<0.05)，而BCL2 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，其中miR-509-3p在乳腺癌MDA-MB-231細胞中的表達水平降低幅度最顯著，因此后續(xù)實驗中選取乳腺癌MDA-MB-231細胞為研究材料，見表1、表2。

表1 乳腺癌組織中miR-509-3p與BCL2的表達

表2 乳腺癌細胞系中miR-509-3p與BCL2的表達

與MCF-10A相比：1)P<0.05

2.2上調miR-509-3p表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖及凋亡率的影響 與miR-NC組相比，miR-509-3p組乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖活性顯著降低(P<0.05)，而細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，CyclinD1蛋白水平明顯降低(P<0.05)，而p21蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖1、圖2、表3。

圖1 流式細胞術檢測各組細胞凋亡

1～3：空白對照組、miR-NC組、miR-509-3p組；圖3同圖2 Western印跡法檢測各組細胞增殖相關蛋白表達

2.3上調miR-509-3p表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移及侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-509-3p組乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移及侵襲細胞數(shù)均顯著減少(P<0.05)，MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見表3、圖3。

表3 各組細胞增殖率、凋亡率及遷移、侵襲能力比較

與miR-NC組相比:1)P<0.05

圖3 上調miR-509-3p表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移及侵襲相關蛋白表達的影響

2.4miR-509-3p靶向調控BCL2 starBase網(wǎng)站預測miR-509-3p的靶基因，結果顯示BCL2的3′UTR中含有與miR-509-3p互補的核苷酸序列，見圖4。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與共轉染miR-NC、BCL2-WT組相比，miR-509-3p mimics與BCL2-WT共轉染組細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與共轉染miR-NC、BCL2-MUT組相比，miR-509-3p mimics與BCL2-MUT共轉染組細胞熒光素酶活性變化無顯著性差異(P>0.05)，見表4。進一步探究二者間調控關系，結果顯示，與miR-NC組(0.88±0.12)相比，miR-509-3p組(0.45±0.10)細胞中BCL2蛋白水平顯著降低(P<0.05)，相對于anti-miR-NC組(0.71±0.11)，anti-miR-509-3p組(1.16±0.09)細胞中BCL2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖5。

圖4 BCL2的3′UTR中含有與miR-509-3p互補的核苷酸序列

組別BCL2-WTBCL2-MUTmiR-NC組1.03±0.111.08±0.07miR-509-3p組0.43±0.051.07±0.11t/P值14.897/0.0000.230/0.821

2.5BCL2過表達逆轉上調miR-509-3p表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的作用 與miR-509-3p+pcDNA組相比，miR-509-3p+pcDNA-BCL2組乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖活性顯著升高(P<0.05)，遷移及侵襲細胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，MMP-2、CyclinD1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，而細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖6、表5。

1～5：miR-NC組、miR-509-3p組、miR-509-3P+pcDNA組、miR-509-3P+pcDNA-BCL2組圖6 Western印跡法檢測各組乳腺癌MDA-MB-231細胞中相關蛋白表達

表5 各組細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲能力比較

與miR-NC組相比:1)P<0.05；與miR-509-3p+pcDNA組相比:2)P<0.05

3 討 論

miRNA異常表達可參與多種疾病發(fā)生及發(fā)展過程，研究表明miRNA在多種惡性腫瘤中均存在異常表達，并可通過影響腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲等生物學過程進而影響腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔8〕。研究報道指出miR-940、miR-124等在乳腺癌細胞中表達降低，上調其表達可通過抑制靶基因表達進而調控乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲過程〔9,10〕。但仍有部分miRNA在乳腺癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機制尚未完全闡明，因此本研究主要尋找新miRNA分子與乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲等生物學行為的相關性，為尋找乳腺癌靶向治療提供潛在靶點基因。

miR-509-3p通過抑制X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)表達進而抑制胃癌細胞增殖及遷移〔11〕。miR-509-3p可減弱卵巢癌細胞遷移及增殖能力〔12〕。miR-509-3p通過靶向絲裂原活化蛋白激酶8表達進而抑制腎細胞癌細胞增殖及遷移〔13〕。既往研究表明 miR-509-3p靶向細胞周期依賴蛋白激酶(CDK)2、Rac1等多種生長調節(jié)基因，可能有助于有效的抗癌治療〔14〕。本研究結果表明乳腺癌組織及細胞中miR-509-3p的表達下調，與上述文獻報道結果相似，進一步研究顯示上調miR-509-3p表達可明顯降低乳腺癌細胞活性，并可減少遷移及侵襲細胞數(shù)，而促進細胞凋亡，為驗證其作用可能機制，檢測細胞增殖、遷移及侵襲相關蛋白表達，結果顯示CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低，而p21表達水平顯著升高，已有研究報道指出CyclinD1可通過與CDK4/6結合形成依賴于細胞周期蛋白的蛋白激酶(Cyclin-CDK)復合物進而正向調控細胞周期進程，而p21可通過抑制Cyclin-CDK復合物形成進而抑制腫瘤細胞周期進展，抑制細胞增殖，MMP-2、MMP-9作為基質金屬蛋白酶家族成員，其可通過降解細胞外基質沉積進而促進細胞發(fā)生轉移〔15，16〕。提示上調miR-509-3p表達可通過調控乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡過程進而參與乳腺癌發(fā)生及發(fā)展過程。

長鏈非編碼(Lnc)RNA H19可通過靶向調控BCL2基因表達進而影響宮頸癌細胞生物學行為〔17〕。miR-204過表達可能通過抑制BCL2基因表達進而抑制卵巢癌細胞增殖并誘導細胞凋亡〔18〕。BCL2基因表達異常涉及細胞增殖、腫瘤形成等多種過程，并可直接影響腫瘤細胞遷移及侵襲等生物學行為〔19，20〕。本研究結果顯示BCL2在乳腺癌組織及其細胞中的表達水平增高，提示BCL2基因表達水平升高可能促進乳腺癌發(fā)生。靶基因預測顯示BCL2基因可能是miR-509-3p的靶基因，通過雙熒光素酶報告基因實驗證明miR-509-3p可靶向結合BCL2基因并可負向調控其表達，進一步研究顯示上調BCL2基因表達可逆轉miR-509-3p過表達對乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用及其對細胞凋亡的促進作用。提示上調miR-509-3p表達可通過抑制BCL2基因表達進而減弱乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力，誘導細胞凋亡。

綜上所述，miR-509-3p在乳腺癌組織及細胞中低表達，而BCL2基因高表達，上調miR-509-3p表達可通過下調靶基因BCL2表達進而抑制細胞增殖、遷移及侵襲并促進其凋亡，本研究結果證實miR-509-3p在乳腺癌發(fā)生轉移過程中發(fā)揮重要作用，可豐富乳腺癌細胞轉移的分子機制，可為臨床乳腺癌基因治療提供潛在靶點。