Bacillus subtilis VD18R19脂肽類產物鑒定及其對胡椒花葉病的田間生防效果①

高圣風 王 鋒 劉愛勤 茍亞峰 孫世偉 王 政 孟倩倩

(1中國熱帶農業科學院香料飲料研究所 海南萬寧571533;2海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質調控重點實驗室 海南萬寧571533;3云南農業大學熱帶作物學院 云南普洱665000)

芽孢桿菌（Bacillusspp.）廣泛存在于自然環境中，具有綠色、廣譜、易培養、耐儲藏、耐逆境等特點，是目前研究最廣泛、最深入的根際促生細菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR）種類之一［1-2］，也是中國登記、使用最多的生防菌之一。脂肽類化合物是芽孢桿菌產生的重要次級代謝產物，包括表面活性素（Surfactins）、伊枯草菌素（Iturins）和泛革素（Fengycins）等抗生素家族，具有抑制病原菌、誘導寄主抗性、促進植株生長等多種生防活性［3-4］。如B.amyloliquefaciensVX2R11 產生的表面活性素和伊枯草素對香草蘭根（莖）腐病菌（Fusarium oxysporum）、疫病菌 （Phytophthora nicotianae）和香草蘭細菌性軟腐病菌（Dickeya dadantii）等病原真菌、卵菌和細菌具有良好的的抑制菌絲生長效果［5］；B.subtilis9407產生的泛革素能夠有效防控蘋果輪紋病［6］；表面活性素高產菌株B.subtilisOKBHF能刺激番茄產生誘導系統抗性 （Induced Systemic Resistance，ISR）物質，有效防控番茄青枯病和花葉病毒病［7-8］。

胡椒（Piper nigrumLinn.）是一種經濟價值極高的多年生香料作物，廣泛種植于世界熱區各國，目前中國胡椒種植面積居世界第6位。胡椒花葉病是由黃瓜花葉病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）引起的胡椒病毒性病害，普遍發生于中國各胡椒產區，可造成約30%的經濟損失，是危害中國胡椒產業發展的主要病害之一［9-10］。但實際生產往往缺乏有效防控胡椒花葉病手段，國內外也尚未有利用PGPR防控胡椒花葉病的報道。

生防菌B.subtilisVD18R19是近年來分離的生防菌株，具有定殖能力強、防病譜廣、易遺傳轉化等特點，已被完全測序［11-12］。通過比較基因組學研究預測，VD18R19基因組中含有2個脂肽類化合物編碼基因簇［13］。本研究開展B.subtilisVD18R19脂肽類產物提取、鑒定研究，分析該菌株及其脂肽類化合物對胡椒花葉病的生防效果，為利用生防芽孢桿菌防控胡椒花葉病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及處理液

生防菌株B.subtilisVD18R19來源于海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質調控重點實驗室，保存于-80℃培養基中。VD18R19處理液是生防菌發酵液離心收集菌體后重懸至107cfu/g的菌懸液（自制）；脂肽類化合物處理液是生防菌脂肽類提取物（自制）稀釋1 000倍液；阿泰靈處理液是植物免疫調節劑阿泰靈（北京中保綠農科技集團有限公司）稀釋1 000倍液；清水對照是農田灌溉用水。所有處理液均用灌溉用水稀釋。

1.1.2 培養基

生防菌培養所用培養基為Luria-Bertani（LB）培養基：10 g胰蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母粉，去離子水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min。生防菌發酵所用培養基為Landy培養基：5 g L-谷氨酸、0.5 g MgSO4、0.5 g KCl、1 g酵母粉、1.5×10-4g Fe2SO4·6H2O、 5.0×10-3g MnSO4·H2O、 1.6×10-4g CuSO4·5H2O、2.0×10-3g L-苯丙氨酸，定容至1 000 mL，pH調至7.0，121℃滅菌20 min，使用前補充2%的葡萄糖和1‰的KH2PO4。

1.1.3 試驗材料

試驗地點為瓊海市大路鎮中國熱帶農業科學院香料飲料研究所試驗基地；選擇已種植約2年、長勢均一、花葉病病株率為6.67%、病株分布均勻、30 d前統一修剪了主蔓的胡椒園。

1.2 方法

1.2.1 VD18R19的發酵及脂肽類化合物的提取

將生防菌株B.subtilisVD18R19接種到裝有50 mL LB培養基的三角瓶中，于37℃200 r/min震蕩培養12 h。然后將培養液按3%比例轉接到裝有1 000 mL Landy培養基的三角瓶中，于30℃200 r/min震蕩發酵30 h。采取酸沉淀法提取脂肽類化合物［14］：即將生防菌發酵液8 000 g離心10 min，保留上清液；將上清液pH調至2.0，靜置2h，8000g離心10 min，收集沉淀，60℃恒溫干燥箱至完全干燥，即為粗提物；加入10 mL甲醇（色譜純），pH調至7.0，充分搖勻溶解，12 000 g離心5 min，保留上清液。將多次提取的上清液合并，用尼龍濾膜（孔徑，50μm）過濾，將獲得的提取物于-20℃保存備用。為估算脂肽類化合物產量，隨機抽取3份生防菌發酵液，每份1 000 mL，將粗提物和提取物分別放入60℃烘箱干燥至恒重后稱取干重。

1.2.2 脂肽類化合物鑒定

將1.2.1中脂肽類化合物通過AB SCIEX 5800儀器進行質譜（MALDI-TOF/TOF-MS）檢測，用337 nm氮激光源解吸附和電離。使用的基質是α-氰-4-羥肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid）。

1.2.3 田間防控胡椒花葉病試驗

設置生防菌VD18R19、脂肽類化合物提取物、植物免疫誘抗劑（阿泰靈）和清水對照4個處理，每處理3個重復，每個重復20株胡椒。各處理液配好后同時進行灌根（2.5 L/株）和葉面噴霧處理，60 d后依照病情分級標準調查各處理胡椒花葉病嚴重度，并計算病情指數和防效。同時測量胡椒冠幅、最大果枝長度，計算促生率。另從各處理中選出長勢和病情較為一致的植株進行定點編號，記錄處理前后的植株長勢和病害情況。

胡椒花葉病病情分級標準：0級，無病害癥狀；1級，病葉率＜5%；3級，5%≤病葉率＜15%；5級，15%≤病葉率＜35%；7級，35%≤病葉率＜75%；9級，病葉率≥75%。

1.2.4 數據處理

所有數據均采用SPSS 16.0軟件進行處理，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），費雪最小顯著差異檢驗（Fisher’s least-significant difference test，LSD）（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 Bacillus subtilis VD18R19脂肽類產物提取和鑒定

生防菌VD18R19發酵液中可以提取到脂肽類化合物，其粗提物和提取物的平均產量分別為5.92、3.13 g/L。由圖1可知，MALDI-TOF/TOF-MS檢測結果顯示有2簇峰：在m/z值為988·4123、1002·4224、1016·4399、1032·4147、1 044·6182、1060·6017 處有離子峰出現，這簇離子峰對應于表面活性素的分子質量；在m/z值為1471.7305、1485.7479、1499.7640、1513.7786、1529.7640處有離子峰出現，這簇離子峰對應于大側柏素分子質量。這說明生防菌VD18R19能夠大量產生脂肽類化合物，主要為表面活性素和大側柏素2種成分。

2.2 田間生防效果

由表1可知，相對于清水對照，灌根和噴霧處理60 d后，生防菌VD18R19、脂肽類提取物和阿泰靈3處理均能有效降低胡椒花葉病的嚴重度，其中生防菌VD18R19和脂肽類提取物2處理的防效較好，分別達79.49%、87.18%；此外，3處理對胡椒的生長均有一定程度的促進作用，其中VD18R19對胡椒冠幅和最大果枝長度的促進作用達顯著水平（LSD，p＜0.05）， 促 生 率 分 別 為 10.10% 和15.55%，。由表2、圖2～3可知，處理前病情分級為3、5級，葉片斑駁扭曲，病葉較窄，病枝節間距較短，病情和長勢較為一致，處理間差異均不顯著。處理60 d后，清水對照的病情分級上升為7級，新葉更小且嚴重斑駁扭曲，新枝節間距更加縮短；其他處理病情分級均降至1級，新生葉片形狀、顏色基本正常（僅阿泰靈處理的新葉顏色略顯斑駁），新葉寬度和新枝節間距均有明顯增加，統計數值顯著高于清水對照。說明生防菌VD18R19及其脂肽類提取物均具有良好的防控胡椒花葉病和促進植株生長效果，具有良好的應用潛力。

圖1 脂肽類提取物MALDI-TOF/TOF-MS檢測結果

表1 不同處理對胡椒花葉病的田間生防效果

表2 處理前后代表植株感病部位的病害嚴重度

3 結論與討論

枯草芽孢桿菌產生的脂肽類化合物主要有伊枯草菌素、泛革素和表面活性素3大家族，其中伊枯草菌素、泛革素具有較強的抑制真菌和卵菌活性，而表面活性素對眾多卵菌、真菌、細菌、支原體、病毒、腫瘤細胞等具有廣譜抑制活性，被廣泛應用于生物制藥和作物病害防治［3-8］。本研究發現，B.subtilisVD18R19能產生表面活性素和大側柏素2種脂肽類化合物，分屬表面活性素家族和泛革素家族。田間試驗表明，該菌株及產生的脂肽類化合物對胡椒花葉病表現出良好的防治效果，防效分別達79.49%和87.18%，極具應用潛力。

通過比較基因組學預測B.subtilisVD18R19含有表面活性素和大側柏素2個脂肽類化合物編碼基因簇［13］，與本研究脂肽類化合物質譜鑒定結果一致。粗提物干重為5.92 g/L，接近于王帥等報道的產量［14］，遠高于劉佳欣等的報道［15］。但本研究的提取物未進行液相色譜純化，提取物干重不宜與純化后的干重直接進行比較。

圖2 不同處理對代表性病株的影響

圖3 代表植株感病部位在處理前后的病害情況

有研究顯示，B.subtilisVD18R19對多種胡椒和香草蘭病原真菌、卵菌和細菌具有生防活性［5，11-12］。本研究再次拓寬B.subtilisVD18R19的活性范圍，證實了該菌株具有防控胡椒花葉病活性。Wang等［7］通過酶聯免疫方法對盆栽番茄進行研究，發現生防菌B.subtilisOKB105和B.amyloliquefaciensFZB42灌根處理能夠顯著降低新葉中黃瓜花葉病毒的數量；OKB105菌株能產生表面活性素［16］，FZB42菌株能產生表面活性素、Bacillomycin D和泛革素［17］。本研究中，菌株B.subtilisVD18R19產生表面活性素和泛革素。田間試驗證實，該菌株及脂肽類化合物均能有效防控胡椒花葉病，這在胡椒花葉病生物防治上尚屬首例，但有關防控胡椒花葉病的具體機制有待于后續進一步研究。