蛭弧菌CS258的分離鑒定及裂解特性

葛寶霖 史學(xué)華 徐晨瀟

摘 要：以大腸桿菌為宿主，從養(yǎng)殖水中分離得到5株蛭弧菌菌株，對(duì)其中裂解效果最好的蛭弧菌CS258進(jìn)行進(jìn)一步研究。結(jié)果表明，蛭弧菌CS258的最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適pH為7.5。蛭弧菌CS258作為一種“活的抗生素”，具有很大的發(fā)展空間和應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：蛭弧菌;裂解特性;分離;鑒定

中圖分類號(hào) Q939文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）21-0040-03

Abstract：In this project，five Bdellovibrio-and-like organisms （BALOs） were isolated from6 ?strains of bacteria were isolated from water samples from breeding pond using bacterium Escherichia coli as the host. Strain CS258 with the best lysing characteristic was selected further studied. The results showed that the optimal growth temperature of strain CS258 was 30℃，and the optimum pH is 7.5.The research results show that CS258 as a "living antibiotic" has a strong development space and application value.

Key words：Bdellovibrio;Lysing Characteristics;Isolation;Identification

1962年Stolp[1]等人首次從菜豆葉燒病假單胞菌中分離獲得蛭弧菌，由此人們開始對(duì)蛭弧菌展開研究。研究發(fā)現(xiàn)，蛭弧菌是一類寄生性的革蘭氏陰性細(xì)菌[2]，可以進(jìn)攻其它細(xì)菌進(jìn)而使自身獲得營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行增殖，并能導(dǎo)致宿主菌的裂解[3]。蛭弧菌的個(gè)體比較小，大小一般為0.3～0.6×0.8～1.2μm，且能通過細(xì)菌濾器，一端具有鞭毛，一般呈弧狀或者桿狀[4]。因?yàn)轵位【荒芮秩菊婧思?xì)胞[5]，因此其對(duì)生物的無毒害性使得它成為了養(yǎng)殖業(yè)、食品保鮮業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的搶手品。

近幾年來，越來越多的學(xué)者致力于對(duì)蛭弧菌的研究開發(fā)中，包括我國“蛭弧菌第一人”秦生巨[6]、孫秋平[7]等人均對(duì)蛭弧菌的發(fā)展貢獻(xiàn)了自己的力量。本實(shí)驗(yàn)選取養(yǎng)殖水中分離得到的1株蛭弧菌，從溫度、pH值等方面研究其最適生長(zhǎng)條件，為蛭弧菌的長(zhǎng)期培養(yǎng)、在水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 蛭弧菌分離自養(yǎng)殖水中;宿主株（大腸桿菌）為實(shí)驗(yàn)室分離并保藏。

1.1.2 試劑 酵母膏、蛋白胨、瓊脂粉、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、自來水、蒸餾水等。

1.1.3 培養(yǎng)基的配制 LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化鈉10g、自來水1000mL，用2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.2～7.5。在102.9kPa高壓、121℃下蒸汽滅菌20min后備用。雙瓊脂培養(yǎng)基：上層0.7%瓊脂培養(yǎng)基（自來水1000mL、瓊脂7g）;下層1.75%瓊脂培養(yǎng)基（自來水1000mL、瓊脂17.5g）。上、下層培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，在102.9kPa高壓、121℃下蒸汽滅菌20min后備用。

1.1.4 儀器和設(shè)備 電子天平、pH計(jì)、恒溫振蕩器、高溫高壓蒸汽滅菌鍋、雙人單面凈化工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱、數(shù)顯恒溫水浴鍋、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、冰箱、移液槍、微波爐、pH試紙、酒精燈、培養(yǎng)皿、錐形瓶、試管、試管架、量筒、玻璃棒、燒杯等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 （宿主）大腸桿菌菌懸液的制備 實(shí)驗(yàn)前1d，從大腸桿菌固體培養(yǎng)基上挑取分離純化后的單菌落接種至含5mLLB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)10～12h，確保大腸桿菌的活力。

1.2.2 蛭弧菌的分離純化 采用雙層瓊脂平板法[8]分離蛭弧菌，將已滅菌的下層1.75%瓊脂培養(yǎng)基倒平板備用;將取得的養(yǎng)殖水在轉(zhuǎn)速為1000rpm、溫度為4℃的條件下離心5min，備用;將0.3mL宿主大腸桿菌、0.5mL離心后的養(yǎng)殖水上清液和7mL上層0.7%瓊脂培養(yǎng)基充分混勻，倒入已凝固的下層培養(yǎng)基中，凝固后于在28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置放培養(yǎng)3～6d，定期觀察噬菌斑出現(xiàn)的情況。用單斑傳代法[9]，從雙層瓊脂平板上挑取1個(gè)直徑較大的噬菌斑，置于含有浸出液的試管中，放在28℃、150rpm的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)5h，代替養(yǎng)殖水，重復(fù)多次分離的步驟，直至平板上出現(xiàn)形態(tài)一致且無雜菌的噬菌斑。

1.2.3 蛭弧菌菌液的制備 將用1.2.2中分離獲得的蛭弧菌，用接種環(huán)接種于200μL無菌水中，無菌水變渾濁時(shí)即為蛭弧菌菌液，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 噬菌斑形態(tài)觀察 本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌為宿主菌，采用的是雙層瓊脂平板法。經(jīng)過60h培養(yǎng)后觀察其形成的噬菌斑的形態(tài)和大小。

1.2.5 液體培養(yǎng)鑒定 待宿主大腸桿菌固體培養(yǎng)長(zhǎng)出菌落后，挑取其菌落并加入滅菌蒸餾水5mL制成宿主菌懸液，取30mL含有203.3mg/L MgCl2·H2O、3.94mg/L CaCl2·H2O的無菌水置于三角瓶中。加入宿主菌懸液0.5mL，再從雙層平板上挑取單個(gè)噬菌斑置于三角瓶中。在28℃下震蕩培養(yǎng)48h觀察溶液是否由混濁變?yōu)槌吻錥10]。

1.2.6 過氧化氫酶鑒定 從雙層平板上挑取單個(gè)噬菌斑置在干凈的載玻片上，滴加1滴3%過氧化氫溶液觀察0.5min內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，能產(chǎn)生氣泡的為陽性，不產(chǎn)生氣泡的為陰性

1.2.7 溫度對(duì)CS258菌株生長(zhǎng)的影響 設(shè)置5個(gè)溫度梯度，分別為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃。將5mL 的大腸桿菌菌懸液和5mL的噬菌斑浸出液加入到裝有90mL的無菌自來水三角瓶中充分混勻，將三角瓶放在恒溫?fù)u床中，根據(jù)5個(gè)溫度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)溫度組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)2d后，再采用雙層平板法培養(yǎng)，每隔12h觀察1次，對(duì)每個(gè)溫度梯度下的培養(yǎng)物采取噬菌斑計(jì)數(shù)，觀察溫度對(duì)CS258菌株裂解特性的影響。

1.2.8 pH對(duì)CS258菌株生長(zhǎng)的影響 設(shè)置5個(gè)pH梯度，分別為6、6.5、7、7.5、8。將5mL的大腸桿菌菌懸液和5mL的噬菌斑浸出液加入到裝有90mL的無菌自來水三角瓶中充分混勻。用稀HCl和稀NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH 值。每個(gè)pH設(shè)置3個(gè)重復(fù)組。將三角瓶放在30℃的恒溫?fù)u床中，培養(yǎng)2d后，倒入雙層平板中，每隔12h觀察1次，對(duì)每個(gè)pH梯度下的培養(yǎng)物采取噬菌斑計(jì)數(shù)，觀察pH對(duì)CS258菌株生長(zhǎng)的影響。

1.2.9 NaCl濃度對(duì)CS258菌株生長(zhǎng)的影響 設(shè)置5個(gè)NaCl濃度梯度，分別為0.25%、1%、2%、3%、4%，對(duì)照組不加NaCl，將5mL的大腸桿菌菌懸液和5mL的噬菌斑浸出液加入到裝有90mL的無菌自來水三角瓶中充分混勻。每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)組。將三角瓶放在30℃的恒溫?fù)u床中，培養(yǎng)2d后，倒入雙層平板中，每隔12h觀察1次，對(duì)每個(gè)濃度梯度下的培養(yǎng)物采取噬菌斑計(jì)數(shù)，觀察Na2+對(duì)CS258菌株生長(zhǎng)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 CS258菌株的分離 本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌為宿主菌，采用雙層瓊脂平板法，根據(jù)噬菌斑的形態(tài)和大小，共從養(yǎng)殖水中分離出5株裂解宿主菌的蛭弧菌菌株，選取裂解特性最強(qiáng)的蛭弧菌CS258為進(jìn)一步研究的對(duì)象。此菌株在48h后開始出現(xiàn)噬菌斑，首先表現(xiàn)為點(diǎn)狀，隨著時(shí)間延長(zhǎng)噬菌斑逐漸擴(kuò)大，培養(yǎng)96h后，噬菌斑的直徑約為2.0～4.0mm，形狀為圓形透明，邊緣整齊（見圖1）。

2.2 噬菌斑的鑒定

2.2.1 噬菌斑形態(tài) 以大腸桿菌為宿主，采用雙層瓊脂平板法，培養(yǎng)60h后，得到肉眼可見的透明圓斑，其平均直徑在1mm左右、形狀為圓形透明、邊緣整齊。形成的噬菌斑見圖1。

2.2.2 過氧化氫酶鑒定 從平板上挑取的單個(gè)噬菌斑，滴加了1滴3%過氧化氫溶液，30s后無氣泡產(chǎn)生（圖1）。

2.2.3 液體培養(yǎng)鑒定 在含有203.3mg/LMgCl2·H2O、3.94mg/LCaCl2·H2O的無菌水中加入0.5mL的宿主菌懸液，并挑取單個(gè)噬菌斑置于溶液中，在28℃下恒溫震蕩24h，24h后，溶液由渾濁變?yōu)橥该鳎▓D1）。

2.3 影響CS258菌株生長(zhǎng)的因子

2.3.1 溫度 由表1可知，不同溫度條件對(duì)CS258菌株的生長(zhǎng)有著很顯著的影響。該CS258菌株在25～40℃下培養(yǎng)3d～5d后，在雙層平板上都可以正常生長(zhǎng)，但溫度在高于45℃時(shí)則不能正常生長(zhǎng)，CS258菌株在25℃下裂解效果比在30℃～40℃下差，形成的噬菌斑也小于后者形成的噬菌斑。結(jié)果說明，該CS258菌株屬于嗜中高溫性細(xì)菌。

2.3.2 pH值 由表2可知，該CS258菌株對(duì)pH適應(yīng)范圍較廣，從pH6.0～8.0范圍內(nèi)蛭弧菌均能發(fā)揮裂解特性。當(dāng)pH為6時(shí)，蛭弧菌CS258裂解宿主大腸桿菌需要64h，而且形成的噬菌斑數(shù)量少、不清晰。隨著pH的增大，出斑時(shí)間都穩(wěn)定在53h左右，CS258菌株噬菌斑的量在pH值7.5時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)pH在8時(shí)，形成的噬菌斑明顯減少。結(jié)果說明，該CS258菌株更適宜在弱堿的環(huán)境下生長(zhǎng)。

2.3.3 NaCl 結(jié)果表明，CS258菌株的生長(zhǎng)與NaCl濃度有關(guān)。當(dāng)NaCl濃度較低時(shí)，菌株CS258生長(zhǎng)速度快，形成噬菌斑的時(shí)間短，形成的噬菌斑透明程度高;在NaCl濃度高時(shí)，CS258菌株的數(shù)量下降，形成噬菌斑所需時(shí)間長(zhǎng)，總的數(shù)量也少。結(jié)果說明，該CS258菌株適合在低濃度的NaCl濃度環(huán)境下生長(zhǎng)。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)從養(yǎng)殖水中取得含有蛭弧菌的水樣，經(jīng)過初步篩選，從中分離得到了1株蛭弧菌CS258。蛭弧菌CS258菌株在溫度25℃～40℃范圍下都能生長(zhǎng)，最適宜的生長(zhǎng)溫度在30℃左右;pH在6～8范圍內(nèi)可以生長(zhǎng)，最適合的pH值為7.5左右。馬蘭[11]等人的研究表明蛭弧菌的最適生長(zhǎng)pH為8，最適生長(zhǎng)溫度為35℃。彭宗輝[12]等人從深圳灣海泥中分離出的2株蛭弧菌，最適生長(zhǎng)pH均為7.2，最適生長(zhǎng)溫度分別為25℃和30℃。本研究與這些研究的蛭弧菌生長(zhǎng)條件有些差異，這主要是由于不同的蛭弧菌菌株間的差異所致。

蛭弧菌可以裂解治病菌，這一特性特性使其在水產(chǎn)養(yǎng)殖[13-14]、家禽養(yǎng)殖[15]、凈化養(yǎng)殖水體[16-17]、食品安全[18]和醫(yī)療方面有很大的利用價(jià)值。但蛭弧菌在生物防治應(yīng)用中仍然有很多問題需要解決。一是蛭弧菌的培養(yǎng)時(shí)間需要1周左右，培養(yǎng)周期相對(duì)較長(zhǎng)。如何進(jìn)一步縮短培養(yǎng)時(shí)間，并且進(jìn)一步提高蛭弧菌的裂解活性，是急需要解決的問題。二是培養(yǎng)基的選擇相對(duì)單一，蛭弧菌的培養(yǎng)多采用的是雙層平板法，培養(yǎng)比較復(fù)雜。如何簡(jiǎn)化培養(yǎng)條件是當(dāng)今亟待解決的另一重要問題。三是蛭弧菌培養(yǎng)過程中的污染問題。由于其培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，如何在大批量培養(yǎng)和應(yīng)用中有效避免蛭弧菌受到其他雜菌的污染，也需要解決。四是產(chǎn)品的安全性問題。目前，蛭弧菌對(duì)人體和動(dòng)物都是無害，但是在今后更加廣泛的研究過程中，蛭弧菌究竟對(duì)人體是否完全沒有毒害作用還需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來支持。因此，廣泛的應(yīng)用還需要做大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)

[1]Giaquinta R T. Phloem Loading of Sucrose[J]. Annual Review of Plant Physiology & Plant Molecular Biology，2003，34（34）：347-387.

[2]孫秋平.蛭弧菌的分離純化及保質(zhì)期的研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2014.

[3]馬輝.噬菌蛭弧菌的特性、作用機(jī)理及應(yīng)用[J].中國水產(chǎn)，2007，375（2）：91-92.

[4]朱乾根.天氣學(xué)原理和方法[M].北京：氣象出版社，2007.

[5]Skjermo J，Vadstein O. Characterization of the bacterial flora of mass cultivated Brachionus plicatilis[M].Rotifer Symposium VI. Springer Netherlands，1993.

[6]吳群鳳，秦生巨.中國蛭弧菌第一人[J].當(dāng)代水產(chǎn)，2013（9）：36-40.

[7]孫秋平，蔡俊鵬.高濃度蛭弧菌的發(fā)酵制備及其在預(yù)防羊乳腺炎中的應(yīng)用[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013（21）：22-25.

[8]謝群英，房文紅，喬振國.海水蛭弧菌分離純化方法初步研究[J].海洋漁業(yè)，2006，28（3）：211-216.

[9]李麗.淡水源蛭弧菌的分離、鑒定與裂解特性研究[D].上海：上海海洋大學(xué)，2013.

[10]溫崇慶，薛明，周世寧.四個(gè)類群海洋蛭弧菌類生物生長(zhǎng)特性的比較[J].微生物學(xué)通報(bào)，2009，36（6）：815-820.

[11]馬蘭，趙博涵，譚天宇，等.蛭弧菌裂解泛耐藥革蘭氏陰性菌及培養(yǎng)條件研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，52（4）.

[12]彭宗輝，蔡俊鵬，吳冰，等.兩株海洋蛭弧菌的分離及生物學(xué)性質(zhì)[J].微生物學(xué)報(bào)，2008，48（11）：1425-1431.

[13]許少丹.噬菌蛭弧菌應(yīng)用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012（6）：330-332.

[14]沈勤，謝榮林，呂偉清，等.噬菌蛭弧菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用及展望[J].河北漁業(yè)，2008，（10）：1-4.

[15]楊先樂，曹海鵬，錢云云.噬菌蛭弧菌--水產(chǎn)動(dòng)物病害生物防治的新工具[J].淡水漁業(yè)，2006，36（2）：55-60.

[16]李怡，曹海鵬，陳水祥，等.噬菌蛭弧菌對(duì)烏鱧養(yǎng)殖水質(zhì)的影響[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2008，（2）：11-14.

[17]張梁，沈建忠，陳佳毅.噬菌蛭弧菌對(duì)草魚池水質(zhì)及細(xì)菌群落的影響[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2009，2（1）：6-10.

[18]鮑星，蔡俊鵬.蛭弧菌消除鮮切香芹大腸桿菌試驗(yàn)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（19）：90-92.

（責(zé)編：楊 林）