響應面優化超聲波輔助提取金耳多糖的研究

蔣 益 鄭惠華 劉廣建 薛 璟* 季宏更 張蕾

（1江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫214063；2江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇南通226009）

金耳（Tremellaaurantialba）又稱腦耳、黃木耳等，隸屬銀耳科、銀耳屬，為我國特有的一種珍稀食藥用菌[1]。金耳膠質細膩，清潤可口，中醫認為其有化痰、止咳、定喘、調氣、平肝陽之功效[2]。金耳多糖是金耳的主要活性成分之一，研究證實金耳多糖具有調節機體免疫能力、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、抗輻射等多種藥理活性[2]。金耳菌種為復合菌種，金耳多糖按提取來源不同分為子實體多糖、菌絲體多糖、發酵液胞外多糖和酵母狀分生孢子多糖。在潮濕條件下，金耳成熟的擔孢子容易類似酵母菌那樣以芽殖方式產生大量酵母狀的分生孢子，這種分生孢子能以芽殖的方式不斷增殖[3]，因而可以利用金耳酵母狀分生孢子發酵生產多糖。在適宜條件下得到恒定的多糖成分，且具有周期短、成本低、不受季節的影響、可大規模工業化生產等優點。因此，以液體發酵金耳分生孢子提取多糖具有廣泛地開發應用前景和科學意義。

目前食藥用菌多糖的提取方式主要有水提醇沉法、酸堿浸提法、酶法、超聲波法、微波法和超臨界流體萃取法等。單純用水浸提時間長，效率低[4]；酸堿提取易引起糖降解及糖甘鍵斷裂，從而破壞多糖活性結構[5]。水解酶的價格高、易失活，在生產上應用困難[6]。超聲波法是利用超聲波的空化效應增加溶劑穿透力，提高細胞內組分的溶出速度和溶出次數；該法既可以在常溫下較溫和地將食藥用菌細胞分解、保持細胞組分的生物活性，又可較大幅度提高多糖等有效成分的提取率[7]。近年來，超聲波輔助提取技術在多糖提取工藝領域得到了廣泛的應用，其中，在蟲草花多糖[8]、銀耳多糖[9]、猴頭菇多糖[10]、楊樹口蘑多糖[11]等食藥用菌多糖的提取中成功應用。

因此，筆者以液體發酵金耳酵母狀孢子及其發酵液為材料，采用超聲波輔助熱水浸提法提取金耳多糖，在單因素試驗的基礎之上，運用響應面統計分析軟件優化多糖提取工藝，以期為金耳多糖的進一步開發利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

（1）供試金耳菌株菌株：金耳酵母狀分生孢子菌株TAY6048，由江蘇省蘇微微生物研究有限公司提供，改良PDA培養基4℃保存。

（2）培養基：改良PDA培養基為馬鈴薯200g煮汁，葡 萄 糖20g，KH2PO41g，MgSO40.5g，加 水1000mL，瓊脂粉20g，pH自然。金耳種子培養基：蔗 糖10g，葡 萄 糖20g，酵 母 膏2g，蛋 白 胨2g，KH2PO41g，MgSO40.5g，加水1000mL，pH自然。發酵培養基為玉米粉30g，豆餅粉10g，蔗糖5g，KH2PO41g，MgSO40.5g，加水1000mL，pH自然。

（3）主要設備：PL203型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SG78型數字pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GKC214恒溫水浴鍋，上海蘇達實驗儀器有限公司；JB90-D攪拌器，上海標本模型廠；TDL-40B臺式低速離心機，上海安亭科學儀器廠；TS-2102型雙層恒溫搖床，上海夢藍儀器設備有限公司；DHG-9245A型恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；JY98-ⅢDN超聲波細胞粉碎機，寧波新藝超聲設備有限公司；721分光光度計，上海光學儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 液體發酵

將活化好的斜面菌種接種于金耳種子培養基中，25℃，150r/min振蕩培養3d后以5%的接種量轉接500mL發酵瓶，每瓶液體量為100mL，25℃、150r/min振蕩培養4d。

1.2.2 多糖提取與制備

按照試驗設計的超聲條件提取，然后在90℃水浴下浸提4h，8000r/min離心10min，取上清液，濃縮至原體積1/5，加入4倍體積的無水乙醇，充分混勻后置于4℃冰箱過夜。第2天取出8000r/min離心10min，棄上清，收集沉淀，凍干即為粗多糖。稱取質量，硫酸-蒽酮法[12]測沉淀多糖含量。此多糖為胞外多糖和胞內多糖之和，將其換算為單位發酵體積的多糖提取量（g/L）。

1.2.3 金耳多糖提取單因素試驗

以單位發酵體積金耳多糖提取量為指標，分別考察超聲功率、超聲時間、超聲溫度對金耳多糖提取量的影響。每組試驗重復3次。

1.2.3.1 超聲功率

設定超聲時間15min，超聲溫度40℃，設定超聲功率200、300、400、500、600、700W，考察不同超聲功率對金耳單位發酵體積多糖提取量的影響。

1.2.3.2 超聲時間

設定超聲功率500W，超聲溫度40℃，分別設定不同的時間5、10、15、20、25、30min提取，考察不同超聲時間對金耳單位發酵體積多糖提取量的影響。

1.2.3.3 超聲溫度

設定超聲功率500W，超聲時間15min，設定溫度分別為35、40、45、50、55、60℃，考察不同超聲溫度對金耳單位發酵體積多糖提取量的影響。

1.2.4 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以單位發酵體積金耳多糖提取量為響應值，以超聲功率（A）、超聲時間（B）和超聲溫度（C）為試驗因素，設計三因素三水平的Box-Benhnken中心組合試驗（表1），對金耳多糖超聲輔助提取工藝進行優化。

1.2.5 數據處理

試驗數據使用Excel進行整理和繪圖；同時利用Design-Expert8.0統計分析軟件進行多元二次回歸模型方程的建立及方差分析，運用該軟件中響應面值優化程序求得當響應面值最大時各因素的最佳組合。

表1 響應面試驗因素與水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲功率對金耳多糖提取量的影響

由圖1可以看出，在其他條件相同的情況下，當超聲功率為200W時，多糖提取量比較低；當超聲功率超過200W低于500W區間內，多糖提取量隨著超聲功率的增加而提高；當超聲功率超過600W多糖提取量下降明顯。因此選擇350W、450W、550W作為中心組合試驗的三個水平。

圖1 超聲功率對金耳多糖提取量的影響

圖2 超聲時間對金耳多糖提取量的影響

2.1.2 超聲時間對金耳多糖提取量的影響

由圖2可以看出，在其他提取條件相同的情況下，超聲時間在5～20min內，多糖提取量隨著超聲時間的延長，逐漸增加，超過20min，隨著超聲時間的延長，多糖提取量緩慢下降。原因可能是在試驗條件下隨著時間延長溶液溫度會升高，過長的超聲時間使得粗多糖中的糖蛋白組分緩慢變性析出，后期的高速離心使糖蛋白以不溶的沉淀狀物質分離出來；另外，隨超聲時間的延長可能還會造成多糖的逐漸降解。因此，選擇超聲時間10、15、25min作為中心組合試驗的三個水平。

2.1.3 超聲溫度對金耳多糖提取量的影響

由圖3可以看出，在其他提取條件相同的情況下，隨著超聲溫度地提高，多糖提取量上升迅速，溫度45℃時，達到最高值，之后隨著提取溫度的上升，多糖提取量下降，當溫度超過50℃時，降速加快。一般來說，溶液溫度的升高，會增加溶劑分子和溶質分子的運動，促進擴散作用，從而有利于提高多糖提取率，但是溫度過高有可能破壞有效成分，降低多糖活性，蛋白質等雜質的析出也將增加，會對后續處理帶來不便。因此，選擇超聲溫度40、45、50℃作為中心組合試驗的三個水平。

圖3 超聲溫度對金耳多糖提取量的影響

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面優化試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Benhnken設計原理，以超聲功率、超聲時間、超聲溫度3個因素為自變量，以金耳單位發酵體積多糖提取量為響應值，采用響應面法進行三因素三水平的試驗設計，共包括17組試驗方案，試驗設計方案及結果見表2。

2.2.2 模型建立與方差分析

利用設計軟件Design-Expert對表2數據進行多元回歸擬合，獲得超聲功率（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）的二次多項回歸方程：

Y=2.86+0.033A+0.011B+0.079C+0.012AB++0.023AC+0.015BC-0.17A2-0.062B2-0.082C2，此回歸模型方程的ANOVA分析結果見表3。

由表3可以看出，回歸模型的P值小于0.0001，說明該二次回歸模型是極顯著的；失擬項P為0.1341，P大于0.05，差異不顯著，未知因素對試驗結果干擾小，說明殘差均由隨機誤差引起；由F值可以看出3個因素對金耳多糖提取的影響程度由大到小依次為超聲溫度（C）＞超聲功率（A）＞超聲時間（B）。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

表3 響應面試驗回歸模型方差分析

同時，模型相關系數R2=0.9925，表明有99.25%的數據可用此方程來解釋，能夠較好地反應金耳多糖提取的變化；模型的調整相關系數R2Adj=0.9828，說明擬合模型方程可靠，有很高的可信度。綜上所述，該二次回歸模型擬合程度好，試驗誤差較小，可用該模型方程對金耳多糖提取條件進行預測和分析。

2.2.3 響應面分析

根據回歸模型，利用Design-Expert8.0.6軟件繪制響應面分析圖和等高線圖（圖4），從響應面分析圖中可以看出各因素交互作用對金耳多糖提取的影響。對金耳多糖提取量影響越大的因素，其曲線走勢會相對越陡。在等高線圖中，各因素對金耳多糖提取的影響體現在其軸向等高線的密集程度上，軸向等高線越密集，說明該因素對金耳多糖提取的影響越顯著。通過比較圖4中響應面分析圖和等高線圖可以看出：超聲時間（B）與超聲溫度（C）兩因素之間的交互作用對金耳多糖提取的影響較為顯著，而其他因素兩兩之間的交互作用對金耳多糖提取的影響較小。

圖4 各兩因素交互作用對金耳多糖提取影響的響應面圖及等高線圖

2.2.4 最佳條件的確定及驗證

通過Design-Expert8.0.6軟件分析得到超聲波輔助提取金耳多糖的最佳工藝條件，即超聲功率518W、超聲時間16min、超聲溫度50℃，此條件下多糖單位發酵體積提取量為2.85g/L，模型預測值為2.88g/L，模型預測值與實測值相比，相對誤差為1.05%。說明試驗建立的二次多項回歸方程能夠有效地反應各因素對金耳多糖提取的影響，用響應面法優化回歸方程模型可行，具有實際可操作性。

3 結論

響應曲面法，采用了合理的試驗設計，能以很少的試驗數量和時間對試驗進行全面研究，從而快速有效地確定多因素系統的最佳條件，并擬合出相應模型，近年來被廣泛應用于眾多生產加工條件的優化控制[13]。諸多研究表明，超聲波功率、超聲溫度、超聲時間是多糖類物質提取的主要影響因素。通過響應面分析，獲得金耳多糖超聲波輔助提取的最佳條件為：超聲功率518W、超聲時間16min、超聲溫度50℃。在此優化條件下，進行3次重復驗證試驗的平均多糖提取量為2.85g/L，與預測值誤差較小，說明經響應面優化后的試驗條件具有實際意義；同時，也表明該模型設計合理，對金耳多糖的最佳提取工藝具有現實指導作用。