一株B 型副雞嗜血桿菌的分離與鑒定

劉龍英

（山東省博興縣畜牧獸醫(yī)局山東濱州256500）

副雞嗜血桿菌是雞傳染性鼻炎的致病菌，該菌感染雞后可引起急性或亞急性上呼吸道傳染病，臨床上該病菌潛伏期短、傳播速度快、發(fā)病率高，且常與其它致病微生物一起引發(fā)混合感染，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。自2018 年6 月份以來，山東濱州博興某養(yǎng)雞場陸續(xù)發(fā)生蛋雞產(chǎn)蛋迅速降低、打噴嚏、鼻孔流出黏液性或膿性分泌物等癥狀，嚴(yán)重者出現(xiàn)顏面腫脹、生長停滯等臨床表現(xiàn)，每天發(fā)病雞不斷增多，但死亡雞6～10 只/d 不等；通過到雞場現(xiàn)場調(diào)研、采樣、實(shí)驗(yàn)室分離鑒定等，最終確診雞群感染副雞嗜血桿菌，并指導(dǎo)該雞場采用有效藥物開展治療及加強(qiáng)免疫等，疫情得到了有效控制。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)室分離鑒定等工作總結(jié)如下。

1 病料采集

從發(fā)病雞場將病死雞取頭或直接制備眶下竇棉拭子后，冷藏送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離研究。

2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將病死的雞頭病料消毒處理后，在無菌條件下，剪開眶下竇，用經(jīng)火焰滅菌并冷卻的接種環(huán)取眶下竇內(nèi)液體或?qū)⒖粝赂]棉拭子分別接種于馬丁肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和含5%雞血清及氧化型輔酶（NAD）的副雞嗜血桿菌固體培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，37℃微需氧條件下培養(yǎng)24～48h。結(jié)果馬丁肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基沒有細(xì)菌生長，而在含血副雞嗜血桿菌固體培養(yǎng)基表面可見不溶血的邊緣整齊、透明、輕微凸起、針狀、細(xì)小的菌落，與副雞嗜血桿菌相似。

3 染色鏡檢

挑取典型的疑似副雞嗜血桿菌涂片后，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢可見該分離菌株為兩極濃染、無芽胞、無莢膜、無鞭毛的革蘭氏陰性小桿菌，與副雞嗜血桿菌相似。

4 PCR 法鑒定與分型

分別應(yīng)用已經(jīng)合成的副雞嗜血桿菌鑒定引物和分型引物進(jìn)行PCR 鑒定，鑒定引物上游序列為5'-GATGGCACAATTACATTTACA-3'，下游序列為5'-ACCTTGAGTGCTAGATGCTGTAGGTGC-3'，擴(kuò)增目的條帶大小為1600bp；A、B、C 型副雞嗜血桿菌共用上游序列為5'-GCTCACAGCTTTATGCAACGAA-3'，A 型下游序列為5'-CGCGGGATTGTTGATTTTGTT-3'，擴(kuò)增目的條帶大小為800bp；B 型 下 游 序 列 為5'-GGTGAATTTCACCACACCAC-3'，擴(kuò)增目的條帶為1100bp；C 型下游序列為5'-TAATTTTCTTATTCCCAGCATCAATACCAT-3'，擴(kuò)增目的條帶大小為1600bp；首先將疑似副雞嗜血桿菌菌落取單菌落加到100μL 滅菌水中，煮沸約10min 后離心取上清當(dāng)做模板，鑒定PCR 反應(yīng)體系為：上下游引物各1μL、模板1μL、PCR mix 12.5μL，補(bǔ)滅菌水至25μL，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照；分型PCR 反應(yīng)體系為上游引物和ABC 三型下游引物各1μL、模板1μL、PCR mix 12.5μL，補(bǔ)滅菌水至25μL，同時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照；反應(yīng)條件分別為98℃預(yù)變性1min，98℃變性10s，鑒定退火溫度為55℃、10s，分型退火溫度為56℃、10s，，72℃延伸2min，共30 循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠板電泳，電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外投射儀上打開紫外燈觀察或用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析，結(jié)果與預(yù)期相符。

5 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將分離菌進(jìn)行純化后，稀釋至50 萬/0.2mL，通過竇內(nèi)途徑接種易感雞，接種后48h 內(nèi)全部發(fā)病。

6 藥敏試驗(yàn)

將分離菌純化后，進(jìn)行常規(guī)藥物的藥敏試驗(yàn)，將強(qiáng)力霉素、慶大霉素、阿莫西林、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、大觀霉素、頭孢噻呋鈉、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉共9 種藥敏片均勻貼在接種分離菌的平板上，37℃微需氧條件下培養(yǎng)24～48h。結(jié)果該分離菌株除對(duì)大觀霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉呈中度敏感外，其余7 種均不敏感耐藥。

7 小結(jié)

通過結(jié)合臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室一系列的檢驗(yàn)等實(shí)際情況，可確診該發(fā)病雞群感染了B 型副雞嗜血桿菌。參考此次藥敏試驗(yàn)的結(jié)果，建議該雞場采用大觀霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉聯(lián)合用藥進(jìn)行治療，治療后疫情有效控制，病雞好轉(zhuǎn)，成年蛋雞產(chǎn)蛋率逐漸恢復(fù)正常，無新發(fā)病例和死亡病例出現(xiàn)。隨后對(duì)整個(gè)雞群進(jìn)行了疫苗強(qiáng)化免疫。研究發(fā)現(xiàn)副雞嗜血桿菌可分為A、B、C 三種血清型，且各型之間沒有交叉保護(hù)，此次疫情分析其原因是由于本地區(qū)一直流行由A 型副雞嗜血桿菌引發(fā)的鼻炎，因此該場定期免疫雞傳染性鼻炎（A 型）滅活疫苗，而該疫苗對(duì)其他型鼻炎沒有交叉保護(hù)的能力，當(dāng)流行株發(fā)生改變時(shí)，不能發(fā)揮保護(hù)能力進(jìn)而造成雞群發(fā)病的情況。

副雞嗜血桿菌極易感染育成雞和蛋雞而發(fā)病，且傳染性極強(qiáng)，能夠迅速蔓延至整個(gè)雞群，因此一旦發(fā)病將給養(yǎng)雞業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失，所造成的經(jīng)濟(jì)損失大小與養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理水平高低及有無繼發(fā)感染等眾多因素密切相關(guān)。當(dāng)前疫苗免疫是防治副雞嗜血桿菌感染的根本措施，適時(shí)接種合適的疫苗能夠有效的預(yù)防雞傳染性鼻炎病的發(fā)生，目前雞傳染性鼻炎（A 型）滅活疫苗應(yīng)用較為廣泛，但鑒于A 型和C 型雞傳染性鼻炎流行趨勢日益突出，臨床上也多選用雞傳染性鼻炎（A 型+C 型）、新城疫二聯(lián)滅活疫苗進(jìn)行全面預(yù)防，無論是種雞還是蛋雞每年需免疫兩次疫苗。鑒于近年來B 型副雞嗜血桿菌分離株不斷出現(xiàn)，故在日常預(yù)防時(shí)應(yīng)加強(qiáng)A、B、C 三型同時(shí)免疫，真正發(fā)揮疫苗的保護(hù)作用。除嚴(yán)格防疫外，副雞嗜血桿菌感染的發(fā)生常與應(yīng)激、飼養(yǎng)管理等誘因密切相關(guān)，因此養(yǎng)殖場應(yīng)注重加強(qiáng)日常飼養(yǎng)管理。保持環(huán)境的衛(wèi)生清潔和舍內(nèi)良好的衛(wèi)生條件，定期消毒，保證雞舍適宜的溫度，平時(shí)要加強(qiáng)舍內(nèi)通風(fēng)換氣，保證供給優(yōu)質(zhì)全價(jià)的飼料，季節(jié)交替等關(guān)鍵時(shí)期更應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，增強(qiáng)雞群抵抗疾病的能力。從根源杜絕病原菌的侵入，外購引進(jìn)雛雞或種雞時(shí)必須嚴(yán)格檢疫。同時(shí)養(yǎng)雞場應(yīng)結(jié)合本場或本區(qū)疫病的實(shí)際情況有計(jì)劃的開展預(yù)防性投藥。一旦發(fā)病疑似病例應(yīng)盡早治療，抗生素類藥物和磺胺類藥物仍是治療雞傳染性鼻炎的重要手段，但應(yīng)避免長期使用一種或錯(cuò)用濫用抗生素等，防止耐藥性的產(chǎn)生。█