不同秋果型樹莓中槲皮素和山奈酚含量的測定

周雙，孫蘭英，楊光，段亞東，張鹍，宋鵬慧，李鵬舉

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄉(xiāng)村振興科技研究所，黑龍江哈爾濱150000）

樹莓（Rubus spp.）為薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus.L.）多年生灌木果樹。樹莓果實(shí)內(nèi)富含豐富的生理活性物質(zhì)，而被譽(yù)為“黃金水果”、“植物界的阿司匹林”。隨著不斷的研究和開發(fā)利用樹莓成為集營養(yǎng)、加工和保健為一體的多功能水果。樹莓含有多種營養(yǎng)活性成分，如：黃酮類、茶多酚、烯烴、花青素、鞣花酸、水楊酸、超氧化物歧化酶等[1-3]。黃酮類化合物廣泛分布于樹莓的植物體中，由于其含有較多的酚羥基團(tuán)，使得樹莓具有清除自由基、預(yù)防心血管疾病、提高免疫力抗菌抗病毒活性等功能[4-6]。有研究表明，黃酮類化合物主要以黃酮苷和糖苷型黃酮存在，進(jìn)入人體的黃酮類化合物，以黃酮糖苷形式存在時(shí)，大部分在小腸壁的阻擋下不能進(jìn)入血液，需要在腸內(nèi)益生菌分泌的水解酶作用下水解成苷元，再重新被吸收進(jìn)入血液，只有以苷元形式存在的黃酮可以直接進(jìn)入血液中，發(fā)揮各種生理作用，黃酮苷元在體內(nèi)的生物利用率明顯高于糖苷型黃酮，并且黃酮苷抗氧化活性明顯優(yōu)于糖苷型黃酮[7-8]。利用高效液相色譜法-電噴霧離子源-離子阱多級質(zhì)譜聯(lián)用儀分離鑒定出，樹莓葉片中含有14 個黃酮類化合物，樹莓黃酮苷主要是槲皮素（quercetin）和山奈酚（kaempferol）。有研究確定槲皮素和山奈酚在抗癌、抗氧化有突出功效，并能抗心肌肥厚、促進(jìn)骨髓中成骨細(xì)胞的形成等藥理作用[6，9-12]。

目前關(guān)于秋果型樹莓槲皮素和山奈酚含量測定卻鮮有報(bào)道。本研究通過高效液相色譜法測定樹莓不同品種、不同部位的槲皮素和山奈酚的含量，以確定樹莓槲皮素和山奈酚的提取部位和品種資源，為進(jìn)一步開發(fā)利用樹莓提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料為3 份秋果型樹莓，均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院漿果研究所漿果育種室樹莓課題組保存，分別采集樹莓果實(shí)、葉片、種子。取材時(shí)間2018 年8 月31日，第一結(jié)果盛期。

槲皮素、山奈酚均為色譜純：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；甲醇、石油醚均為色譜純：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100 高效液相色譜儀：安杰倫科技（中國）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

分別精密稱取槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品適量，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中槲皮素和山奈酚質(zhì)量濃度為0.11 mg/mL，放入冰箱中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 供試品溶液制備

稱取約0.5 g 樣本，放入研缽中磨碎，加入1 mL 預(yù)冷的80%的甲醇，4 ℃浸提過夜，8 000 g 離心10 min，殘?jiān)?.5 mL 預(yù)冷的80%的甲醇浸提2 h，離心后取出上清，合并兩次上清，40 ℃氮吹至不含有機(jī)相，加入0.5 mL 石油醚 60 ℃～90 ℃ 萃取脫色 3 次，棄去上層醚相，下層40 ℃氮吹至干，加入1.5 mL 流動相渦旋振蕩溶解，針頭式過濾器過濾后待測。

1.3.3 色譜條件

流動相的配制：量取600 mL 超純水，加入6 mL 乙酸混勻溶解，加入400 mL 甲醇，混勻。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）液相條件：安捷倫 18 反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），進(jìn)樣量 10 μL，流速 1.000 mL/min，柱溫 30 ℃，走樣時(shí)間為45 min，紫外波長254 nm，設(shè)置完畢保存方法組。用流動相過柱子，待基線穩(wěn)定后，開始加樣。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別置于10 mL 容量瓶中，用色譜純甲醇定容至刻度線，配成系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中槲皮素質(zhì)量濃度依次為0.11、1.1、5.5、11、27.5 μg/mL，山奈酚質(zhì)量濃度依次為 0.11、1.1、5.5、11、27.5 μg/mL。按 1.2.3 色譜條件依次進(jìn)樣 10 μL，分別以槲皮素、山奈酚峰面積為橫坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（μg/mL）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一樹莓樣品5 份，按1.2.2 節(jié)制備供試品溶液，按照1.2.3 節(jié)分別進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行槲皮素、山奈酚峰面積測定，并計(jì)算各自的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.6 儀器精密度試驗(yàn)

吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.2.3 節(jié)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5 次，每次進(jìn)樣10 μL，在相同條件下，測得槲皮素峰、山奈酚峰面積，并計(jì)算各自的RSD。吸取同一供試品溶液，按1.3.3 節(jié)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5 次，測得槲皮素、山奈酚峰面積，并計(jì)算各自的RSD。

1.3.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取0.5 g 同一樣品槲皮素、山奈酚含量已知的樹莓提取物5 份，然后加入槲皮素和山奈酚混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各7.7 μg，按1.2.2 的方法制備供試品溶液，按1.2.3 節(jié)色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，記錄槲皮素、山奈酚峰面積，計(jì)算回收率。

1.3.8 樣品含量測定

按照1.2.2 節(jié)制備供試品溶液，在1.2.4 節(jié)色譜條件下，測定3 份樣品中槲皮素、山奈酚含量，計(jì)算槲皮素、山奈酚的平均含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 保留時(shí)間的確定

將11.00 μg/mL 山奈酚、槲皮素混合對照品溶液按1.2.3 項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，得到對照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 樹莓樣品高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of diagram of raspberry sample

由圖1 可知，樹莓供試品出現(xiàn)與混合對照品中山奈酚（28.979 min）、槲皮素（27.485 min）保留時(shí)間一致的兩個峰。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以峰面積為橫坐標(biāo)，分別以槲皮素和山奈酚的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制槲皮素和山奈酚含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，槲皮素線性回歸方程為：y=0.109x-0.050 5，R2=0.999 8，由于27.5 μg/mL 超出樣品含量最高上限，不參與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，表明在0.11 μg/mL～11 μg/mL內(nèi)槲皮素峰面積值與濃度呈良好的線性關(guān)系；山奈酚線性回歸方程為：y=0.064 6x+0.052 6，R2=0.999 7，表明在 0.11 μg/mL～27.5 μg/mL 內(nèi)山奈酚峰面積值與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

在1.2.5 節(jié)條件下，槲皮素峰面積分別為1.313、1.307、1.301、1.324、1.299，平均峰面積為 1.308，RSD 為0.772 %；山奈酚峰面積分別為 6.850、6.872、6.793、6.889、6.923，平均峰面積為 6.865，RSD 為 0.706%。

2.4 儀器精密度試驗(yàn)

在1.2.6 節(jié)條件下，測得混合標(biāo)準(zhǔn)品中槲皮素峰面積分別為 10.698、10.702、10.782、10.673、10.683，平均峰面積為10.708，RSD 為0.403%；測得混合標(biāo)準(zhǔn)品中山奈酚峰面積分別為 12.848、12.917、12.836、12.793、12.876，RSD 為 0.34%。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

在1.2.8 節(jié)條件下，測得槲皮素的平均回收率為100.65 %（RSD 為0.76 %），山奈酚的平均回收率為99.45%（RSD 為0.91%），結(jié)果見表1。

2.6 樣品含量測定

樣品含量測定見表2。

由表2 可知不同品種、不同部位的槲皮素和山奈酚含量存在差異，槲皮素含量在 0.066 μg/g～46.47 μg/g，山奈酚含量在 0.58 μg/g～3.09 μg/g。哈瑞太茲葉片中槲皮素含量最高，波爾卡種子中槲皮素含量最低，前者是后者的663.9 倍。哈瑞太茲種子中山奈酚含量最高，哈瑞太茲果實(shí)和秋福的葉片中的山奈酚含量低于檢測限，可能含量極少低于機(jī)器的檢測范圍。槲皮素和山奈酚在同一樹莓品種不同部位含量均表現(xiàn)明顯差異。槲皮素在3 個樹莓品種果實(shí)中平均含量為0.79 μg/g，葉片中平均含量為 22.17 μg/g，種子中平均含量為5.47 μg/g，葉片是果實(shí)的28.1 倍；山奈酚在3 個樹莓品種果實(shí)中平均含量為0.49 μg/g，葉片中平均含量為 1.05 μg/g，種子中平均含量為 1.54 μg/g，種子是果實(shí)的3.1 倍。波爾卡、哈瑞太茲、秋福的槲皮素平均含量分別為5.13、20.66、2.64 μg/g，哈瑞太茲平均含量明顯高于其他品種；波爾卡、哈瑞太茲、秋福山奈酚平均含量分別為 0.89、2.34、1.94 μg/g，哈瑞太茲山奈酚平均含量最高。

表1 回收率測定Table 1 Results of recovery

表2 樣品含量測定Table 2 The results of sample

3 結(jié)論

用于測定樹莓黃酮類物質(zhì)測定的方法有紫外分光光度法、雙波長分光光度法、熒光分光光度法，高效液相色譜法等，較其他方法高效液相色譜法具有靈敏度高、高效等特點(diǎn)[13-19]。影響黃酮化合物含量測定的因素很多，有研究表明，不同結(jié)果時(shí)期黃酮類化合物的含量受到影響，最佳采收時(shí)間為第一結(jié)果初期[20]，因此本試驗(yàn)選擇秋果型樹莓第一結(jié)果期的果實(shí)、葉片、種子進(jìn)行測定。

本研究利用高效液相色譜法首次測定了樹莓不同品種、不同部位中槲皮素和山奈酚含量。不同品種的槲皮素含量分別為哈瑞太茲＞波爾卡＞秋福，不同部位的槲皮素含量為葉片＞種子＞果實(shí)，其中哈瑞太茲葉片的槲皮素含量46.47 μg/g，可作為提取槲皮素的植物來源。不同品種的山奈酚含量分別為哈瑞太茲＞秋福＞波爾卡，不同部位的山奈酚含量為種子＞葉片＞果實(shí)，其中哈瑞太茲種子的山奈酚含量為3.09 μg/g。結(jié)果顯示同種樹莓的不同部位槲皮素和山奈酚的含量存在差異，相同部位不同品種對槲皮素和山奈酚含量也存在差異，本試驗(yàn)結(jié)果將為樹莓槲皮素和山奈酚的提取部位和品種資源提供參考依據(jù)。