嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901對酸奶發酵特性及抗氧化活性的影響

李子葉，李柏良，關嘉琪，李慧臻，陸婧婧，占萌，霍貴成

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030）

近年來，我國乳制品行業發展迅速，其中酸奶就是我國乳制品的重要品種之一。由于酸奶具有優良的感官特性和益生特性，深受廣大消費者所喜愛。據統計，發酵乳飲料及酸奶的消費額逐年提升。酸奶的發酵特性直接影響產品品質，因而發酵劑是關鍵[1-2]。酸奶益生作用顯著，既可以整腸，調整人體腸道菌群，還可以有效控制乳糖不耐癥，除去血清中的膽固醇，延緩衰老，延長壽命，促進吸收鈣、磷、鐵等元素[2]。酸奶具有良好的營養價值和保健功能，所以酸奶的產量和銷售量每年以成倍的速度迅速增長，也對菌種的篩選提出挑戰。目前，酸奶及發酵乳飲料生產常用德式乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）作為發酵劑[3-5]。

常存在于人體小腸內的嗜酸乳桿菌，可以產生乳酸、細菌素、過氧化氫等物質，抑制人體腸道內有害菌的生長繁殖，從而調節人體胃腸道微生態。同時，嗜酸乳桿菌還能預防結腸癌，降低體內膽固醇水平。嗜酸乳桿菌因其良好的保健功能和耐酸膽汁鹽的耐受性而被稱為第三代乳酸菌發酵劑，其發展前景十分廣闊。

隨著越來越多的人食用酸奶，酸奶等乳制品的功能性也備受消費者關注。大量對乳酸菌的益生菌特性的研究表明，乳酸菌具有多種抗氧化功能，但不同菌株的抗氧化能力不同。因此對菌株及酸奶的抗氧化性能的研究已經成為了研究新熱點。

故為了開發一種優良的發酵劑和營養價值高的酸奶，本試驗選擇了嗜熱鏈球菌S1、嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901、德式乳桿菌保加利亞亞種KLDS 1.0207 為發酵劑制備酸奶，研究其產酸特性、活菌數含量，并分析所發酵酸奶的物性學特性、風味物質產量，并與國外漢森發酵劑發酵酸奶作對比，最后進行感官評價并對研究了體外抗氧化活性。將清除DPPH、ABTS+自由基及還原能力評價加入嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901 發酵酸奶的體外抗氧化活性研究中，進而開發一種具有抗氧化作用的酸奶。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜熱鏈球菌S1 活菌數2.8×1011CFU/g、德氏乳桿菌保加利亞亞種KLDS 1.0207 活菌數9.4×109CFU/g、嗜酸乳桿菌 KLDS 1.0901 活菌數 1.8×1011CFU/g：東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室提供。

商業酸奶發酵劑：漢森直投式酸奶發酵劑。

鮮奶：東北農業大學食品加工廠；白砂糖：杞參集團。

MRS 固體培養基、M17 固體培養基：奧博星生物技術公司；1.2%NaHSO3溶液：杭州四季青生物工程材料有限公司；0.1mol/LHCl、4mol/L HCl、三氯乙酸溶液：賽默飛世爾科技有限公司；0.1 mol/L 碘液、0.1%淀粉溶液、0.01 mol/L 碘液：新海基因檢測有限公司；1 mol/L NaHCO3溶液、1%鄰苯二胺溶液、1%鐵氰化鉀溶液、1 %十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液、0.2%FeCl3，溶液：天津市光復精細化工研究所；7.4 mmol/L ABTS 溶液、2.6 mmol/L K2S2O8溶液、DPPH溶液、甲醇溶液：天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

DHP-9052 恒溫培養箱：上海捷呈科技有限公司；JY502 型電子分析天平：上海浦春計量儀器有限公司；YJ-875 型醫用凈化工作臺：吳江市生化凈化設備廠；MLS-3751 高壓滅菌鍋：日本 HIRAYAMA 公司；Gemini2 流變儀：英國 Malvine 公司；TG18KR 高速離心機：上海繼譜電子科技有限公司；DU800 紫外分光光度計：美國Beckman 公司；TA-XTi 質構儀：英國 Stable Micro.System 公司；Delta 320 pH 計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸奶的制作工藝

發酵劑成分見表1。

表1 發酵劑成分Table 1 Fermentation ingredients

各取德式乳桿菌保加利亞亞種KLDS 1.0207、嗜熱鏈球菌S1 和嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901 菌粉1 g，分別溶解于10 mL 已滅菌鮮奶中，依次稀釋至活菌數為2.8×106CFU/mL、9.4×106CFU/mL 和 2.1×106CFU/mL。

鮮牛奶→50 ℃預熱→加6%白砂糖混合10 min→巴氏殺菌（65 ℃，0.5 h）→冷卻至 42 ℃→接種（總活菌數2×107CFU/mL）→恒溫發酵至pH4.5→冰浴冷卻至4 ℃→后熟 24 h。

1.3.2 酸奶發酵特性的測定

1.3.2.1 pH 值的測定

采用精密pH 計在25 ℃下測定酸奶的pH 值，同一酸奶樣品測定三次后取平均值。

1.3.2.2 滴定酸度的測定

酸堿滴定法：用標定過的0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液滴定。同一樣品測3 次，取平均值[6]。

1.3.2.3 乳酸菌活菌數測定

酸奶在4 ℃發酵后熟24 h 后參照GB4789.35-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》進行活菌計數。

1.3.2.4 持水力測定

取一定質量（W0）樣品于離心管，3 000 r/min 離心20 min，靜置10 min 后，稱量傾去上清液后剩余樣品質量W。

計算公式如下[7]：

式中：WHC 為持水力，%；W0為樣品質量，g；W 為剩余樣品質量，g。

1.3.2.5 質構測定

探頭進入距離30 mm，測定條件：5 g。測前速率5.0 mm/s，測試速率 1.0 mm/s，測后速率 10.0 mm/s[8]。

1.3.2.6 乙醛的測定

取100 mL 酸奶樣品，向其中加入100 mL 質量分數為16%的三氯乙酸溶液，在3 500 g 轉速下離心10 min后，取上清液備用。

向250 mL 錐形瓶中加5 mL 1%NaHSO3及25 mL上清液，混勻，25 ℃下避光靜置1 h 后，用0.1 mol/L 碘溶液滴定，指示劑為1 mL 淀粉。近終點時用0.01 mol/L的碘標準溶液滴定至藍色。加入20 mL 的1 mol/L 碳酸氫鈉溶液。微開瓶塞，振搖0.5 min。用0.01 mol/L 碘標準溶液滴定至再次出現淡藍色，取100 mL 牛奶做空白對照試驗[9]。

乙醛含量按如下公式計算：

式中：V1為碘標準液用量，mL；V2為空白試劑碘標準液用量，mL；N 為碘標準液當量濃度。

1.3.2.7 雙乙酰的測定

取2 支試管，向其中一支中加10 mL 上清液及鄰苯二胺溶液0.5 mL，混勻。另外一只試管只加入10 mL上清液及2.5 mL 4 mol/L 的鹽酸溶液。第一只試管避光反應0.5 h，再加入2.0 mL 4 mol/L 的HCl 溶液。用紫外分光光度計測335 nm 處第一管的吸光值，第二支作為空白對照。重復測3 次，取平均值[10]。

雙乙酰質量濃度的計算公式如下：

式中：c 為雙乙酰的質量濃度，μg/mL；E 為對應的吸光度值；1.2 為吸光值和雙乙酰的換算系數；0.01 為校正系數。

1.3.2.8 感官評價

選擇都接受過《食品感官鑒定》課程的培訓的10名大學生從外觀、口感、風味、組織狀態和喜愛程度方面對酸奶進行感官評價。酸奶樣品感官評價的標準如表2[11]所示。

表2 酸奶樣品感官評價的評分標準Table 2 Scoring criteria for sensory evaluation of yogurt samples

1.3.3 體外抗氧化活性實驗

1.3.3.1 酸奶水溶性提取物的制備

取10 g 酸奶及15 mL 酸化甲醇于50 mL 的離心管中，12 000 r/min 條件下離心1 min，在-20 ℃下靜置1 h，在7 000 r/min 轉速下再次離心10 min，取上清液，經0.22 μm 濾膜過濾得到酸奶水溶性提取物。

1.3.3.2 DPPH 自由基清除能力

取1.3.3.1 水溶性提取物0.2 mL，加DPPH 自由基工作液2.8 mL，30 min 避光靜置后，測517 nm 處吸光值，空白為甲醇溶液。

計算公式如下：

式中：A對代表對照組的吸光值；A樣代表樣品的吸光值。

1.3.3.3 總抗氧化活力測定

取1.3.3.1 上述水溶性提取物0.3 mL，用甲醇0.7 mL 稀釋后依次加入1 mol/L 鹽酸溶液0.2 mL、1%K3[Fe（CN）6]溶液 1.5 mL、0.2%的氯化鐵溶液 0.5 mL 和1%SDS 溶液0.5 mL。混勻。后去離子水定容至10 mL。靜置30 min 后，在700 nm 處測吸光值。

1.3.3.4 ABTS+自由基清除能力

ABTS+工作液制備：等體積混合7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L K2S2O8溶液，于暗處靜置12 h～16 h，使用前用無水乙醇（pH7.4）調整濃度至吸光值為0.7±0.02。

取0.04 mL1.3.3.1 水溶性提取物加入ABTS+工作液3 mL，避光靜置6 h，測734 nm 處吸光值。計算公式如下：

式中：A對為對照樣在 734 nm 吸光值；A樣為樣品在734 nm 吸光值。

1.4 數據處理

每件樣品均重復3 次測試，數據均按照平均值±標準差的形式表示。借助SPSS17.0 軟件對數據進行分析，數據上角標字母不同即代表具有顯著差異（P＜0.05），字母相同表示差異不顯著（P＞0.05）。

2 結果與分析

2.1 pH 值和酸度

pH 值和酸度是酸奶產品中直接影響酸奶品質的一項重要的理化指標。3 種發酵劑分別接種于牛乳后，將溫度控制在42 ℃，進行發酵，pH 值和滴定酸度見圖1A 和圖 1B。

圖1 不同發酵劑發酵過程中pH 值和酸度的變化Fig.1 Change of pH and acidity of yogurt fermented by different starters

在發酵2 h 前，變化趨于平緩，處于遲緩期，生長及產酸慢。由圖1A 知，在酸奶發酵初期2 h 內，3 號漢森發酵劑pH 值下降速度最快，從6.59 降至5.75，而其他兩種發酵劑pH 值的變化緩慢。發酵4 h 時，未添加KLDS 1.0901 的1 號發酵劑的pH 值快速下降，但添加KLDS 1.0901 的2 號發酵劑的pH 值變化仍較緩慢。到達6 h 時，所有發酵劑的pH 值均下降至4.00～4.50 之間，隨后pH 值變化較小。圖1B 表明，發酵0～4 h 內，3 號漢森發酵劑產酸最快，2 h 后達到35.15°T，添加KLDS 1.0901 的 2 號發酵劑產酸最慢。6 h 后，3 種發酵劑酸度變化趨于平緩且相互之間差異較小。嗜酸乳桿菌可以把蛋白質分解成氨基酸，當其與嗜熱鏈球菌、德式乳桿菌保加利亞亞種混合發酵時，彌補了嗜熱鏈球菌因分解蛋白質的能力較弱而引起的營養上缺陷，進而促進嗜熱鏈球菌的生長，極大程度上縮短了凝乳時間，嗜酸乳桿菌雖然具有較強的分解蛋白質的能力，但其產酸速率較慢。嗜熱鏈球菌在代謝過程中可以產生乳酸、甲酸、CO2產物。事實證明，這3 種產物可不同程度地促進生長，加速凝乳與產酸。酸奶的滴定酸度和pH 值的變化存在差異的原因在于不同發酵劑所含菌株、混合比例、產酸能力不同[12]。

2.2 發酵劑的后酸化能力

后酸化能力是評價酸奶發酵劑品質的一個重要指標，3 種發酵劑發酵的酸奶在20 ℃下放置142 h，每隔24 h 測定pH 值及滴定酸度，結果見圖2A 和圖2B。

由圖2 可知：在上述3 種不同發酵劑發酵的酸奶中，添加嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901 的2 號發酵劑發酵酸奶后酸化能力最強，142 h 后pH 值降低至4.34，滴定酸度增加了27°T；而未添加KLDS 1.0901 的1 號發酵劑發酵酸奶的后酸化能力最弱，142 h 后pH 值降低至4.4，滴定酸度增加了20°T。郭清泉等[14]發現，酸奶后酸化與德式乳桿菌保加利亞亞種有關，乳糖酶受到細胞壁的保護作用，在酸奶在儲存期間，德式乳桿菌保加利亞亞種繼續發酵乳糖，發生后酸化。后酸化程度可以通過調整幾種球桿菌比例來控制。嗜酸乳桿菌具有較強的耐酸能力，可增強其后酸化能力。

圖2 不同發酵劑發酵酸奶20 ℃下儲存pH 值與酸度的變化Fig.2 Change of pH value and acidity of yogurt fermented by different starters

2.3 乳酸菌活菌數

酸奶中乳酸菌的數量直接影響著酸奶的質量，作為一種有益于人體健康的酸奶，它必須含有并保持相當數量的活菌。圖3 所示為3 種發酵劑發酵的酸奶中乳酸菌活菌數。

圖3 不同發酵劑發酵酸奶中乳酸菌活菌數的測定結果Fig.3 Determination results of viable lactic acid bacteria of yogurts fermented by different starters

由圖3 可知，接種等量3 種發酵劑所制得酸奶中乳酸菌活菌數對數值分別為7.61、8.53 lg（CFU/g）和8.72 lg（CFU/g），符合國標[13]。就活菌數而言，3 號顯著高于未添加 KLDS 1.0901 的 1 號發酵劑（P＜0.05），正是由于大量的乳酸菌快速生長繁殖、大量產酸，導致3 號漢森發酵劑發酵酸奶的pH 值和滴定酸度在2 h內變化較大，發酵3 h 后基本凝乳。由于嗜酸乳桿菌可與嗜熱鏈球菌和德式乳桿菌保加利亞亞種共生，添加KLDS1.0901 的2 號發酵劑發酵酸奶中的活性乳酸菌數顯著高于未添加 KLDS 1.0901 的 1 號發酵劑（P＜0.05）。

2.4 酸奶物理學特性

采用TA-XT Plus 質構儀分別測定3 種酸奶樣品的黏性指數、稠度、黏聚性和硬度，以及測定其持水力見表3。

表3 不同發酵劑發酵酸奶的持水力和質構參數Table 3 Water holding capacity and texture analysis of yogurts fermented by different starters

結果如表2 所示，就發酵劑發酵酸奶的持水力而言，2 號與 3 號相近，為 39.8%，3 號較高，1 號最低，僅20.47%。由表2 知，3 號樣品的硬度及稠度均最大，1號樣品的硬度及稠度均最小。酸奶的稠度可以直觀反映其流動性，流動性與稠度成反比[14]。說明3 號發酵劑發酵酸奶流動性最小，1 號發酵劑發酵的酸奶流動性比2 號大。3 號漢森發酵劑的粘聚性和粘性指數均最高，說明其含有更多的粘性菌株。研究人員通常用質構評價酸奶的品質，但其影響因素較多，例如乳酸菌菌種會影響酸奶質構，與產胞外多糖的菌種相反，一些產黏的菌種發酵的酸奶硬度粘度低。其次，酸奶的質構等物理特性也會受到發酵劑菌種的生理狀態及其比例，增稠劑、穩定劑等食品添加劑等的影響[15]。添加了嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901 的酸奶稠度大于未添加KLDS 1.0901 的酸奶，是由于嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901有產黏作用。

2.5 乙醛和雙乙酰產量

酸奶的風味是評判酸奶品質的關鍵指標[16]。故風味物質含量測定在評價酸奶風味過程中起重要作用，酸奶的主要風味物質是乙醛和雙乙酰，前者由德式乳桿菌保加利亞亞種發酵產生，后者由嗜熱鏈球菌發酵產生[17-18]。不同發酵劑發酵酸奶的乙醛和雙乙酰含量如圖4 所示。

圖4 不同發酵劑發酵酸奶的乙醛和雙乙酰含量Fig.4 Acetaldehyde and diacetyl production of yogurts fermented by different starters

由圖4 可知3 種發酵劑發酵的酸奶所產乙醛含量在 14.69 μg/mL～20.19 μg/mL 范圍內，雙乙酰產生量在3.99 μg/mL～9.39 μg/mL。雙乙酰含量最高的是 3 號發酵劑發酵的酸奶，而乙醛含量最高的是未添加嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901 的2 號發酵劑發酵酸奶。許多研究表明只有當酸奶中乙醛含量高于8 μg/mL 時，酸奶風味才有良好保障。由圖4 可知，以上3 種發酵劑發酵的酸奶中乙醛含量均在8 μg/mL 以上。添加KLDS 1.0901的酸奶乙醛含量高于未添加KLDS 1.0901 的酸奶，說明嗜酸乳桿菌也會產生乙醛。

2.6 酸奶的感官評定

感官評價結果見圖5。

圖5 不同發酵劑發酵酸奶的感官評定結果Fig.5 Sensory evaluation results of yogurts fermented by different starters

由圖5 可知，3 種發酵劑制作的酸奶其感官質量均優良。對照3 種酸奶樣品的產酸性能、產雙乙酰含量和乙醛以及質構特性，發現3 號漢森發酵劑發酵的酸奶質地順滑、細膩均勻、粘度高且香氣誘人，因而喜愛程度和綜合評價最高。就組織狀態和風味而言，2 號優于1 號，是由于在發酵過程中嗜酸乳桿菌產生乙醛，且抗酸能力較強，使組織更細膩。

2.7 酸奶體外抗氧化活性

不同的抗氧化物質可通過不同的作用機制來實現其抗氧化的作用，因此，一種方法不能充分的評估復雜食物體系的抗氧化能力。因此，本試驗分別以還原力、ABTS+自由基清除能力和DPPH 自由基清除能力為指標，分析酸奶發酵過程中酸奶的抗氧化能力。

2.7.1 酸奶水溶性提取物DPPH 自由基清除能力

不同酸奶發酵劑發酵酸奶后熟過程中DPPH 自由基清除率如圖6 所示。

圖6 酸奶后熟過程中DPPH 自由基清除率Fig.6 DPPH free radical scavenging rate during yogurt ripening

由圖6 可知，3 組發酵劑發酵酸奶在120 h 的發酵和后熟過程中，DPPH 自由基的清除能力均提高。其中前72 h，DPPH 自由基清除能力增加最為顯著（P＜0.05），增率為57%左右，隨后趨于平緩，且在120 h 達到最大，發酵劑1 號、發酵劑2 號和發酵劑3 號的DPPH 自由基清除率分別為（60.12±0.17）%、（71.22±1.01）%、（82.89±0.32）%，這可能是由于 DPPH 自由基清除能力與蛋白水解的程度有關，隨著后熟時間的加長，酸奶在乳酸菌的作用下蛋白質降解生成了小分子肽，這些小分子肽有些可能具有一定的抗氧化性，所以酸奶的抗氧化活性增強，后熟72 h 后，在產生具有抗氧化性短肽的同時，這些短肽又會被進一步的降解成不具有抗氧化性的氨基酸，所以酸奶的DPPH 自由基清除率趨于平緩。添加KLDS 1.0901 的酸奶DPPH自由基清除率顯著高于未添加KLDS 1.0901 的酸奶（P＜0.05），說明嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901 可以提高酸奶的DPPH 自由基清除能力。

2.7.2 酸奶水溶性提取物還原能力

還原能力與肽鍵斷裂有關，正比于700 nm 處反應產物的吸光度。不同酸奶發酵劑發酵酸奶后熟過程中還原能力如圖7 所示。

圖7 酸奶后熟過程中的還原能力Fig.7 Reducing ability of yogurt during ripening

由圖7 知，在后熟48 h 內3 種酸奶的還原能力沒有顯著性的變化，隨著后熟時間延長而增加，在72 h～120 h 增長極為顯著（P＜0.05），增長率為 78%左右，在120 h 達到最大，發酵劑1 號、發酵劑2 號和發酵劑3號的還原能力分別為 0.413±0.019、0.432±0.002 和0.441±0.012。在后熟 48 h 內，KLDS 1.0901 的添加對酸奶的還原能力沒有顯著的影響（P＞0.05），后熟48 h后，添加KLDS 1.0901 的酸奶的還原力顯著高于未加入 KLDS 1.0901 的酸奶（P＜0.05），與 3 號漢森發酵劑還原能力相似。Lee 等[18]表明還原能力與還原劑的供氫能力密切相關，乳蛋白在菌株蛋白酶的作用下水解生成的抗氧化肽作為還原劑使自由基穩定并終止自由基鏈式反應，從而產生較高的還原能力。

2.7.3 酸奶水溶性提取物ABTS+自由基清除能力

不同酸奶發酵劑發酵酸奶后熟過程中ABTS+自由基清除率如圖8 所示。

圖8 酸奶后熟過程中的ABTS+自由基清除率Fig.8 ABTS+radical scavenging rate during yogurt ripening

由圖8 可知，隨著后熟時間的延長，酸奶的ABTS+自由基清除能力呈現上升的趨勢，尤其在72 h 之前增長速度較快，增長率為70%左右，隨后趨于平緩，在120 h 達到最大，發酵劑1 號、發酵劑2 號和發酵劑3號的ABTS+自由基清除率分別為（37.89±0.19）%、（46.81±0.28）%和（53.16±0.32）%。在 ABTS+自由基清除能力方面，添加KLDS 1.0901 的酸奶和未添加KLDS 1.0901 的酸奶存在著顯著的差異（P＜0.05），這可能是由于ABTS+自由基與加入的嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901作為抗氧化劑，避免了蛋白質與ABTS+自由基之間相互結合，因此導致蛋白質被降解，抗氧化肽生成，增加了酸奶的抗氧化能力[19]。

3 結論

本研究通過評價添加嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901 和未添加嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901 的發酵劑的發酵性能，并將其與漢森發酵劑比較，結果發現2 號發酵劑即添加嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901 的發酵劑生產的酸奶具有良好酸奶風味、質地較為粘稠。而1 號發酵劑即未添加嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901 的發酵劑生產的酸奶可以快速產酸、短時凝乳。鑒于2 號發酵劑具有較高的持水力，豐富活菌，最受喜愛的感官品質和良好的質構特性，其性能類似于3 號發酵劑并優于1 號。不同發酵劑發酵性能差異主要是由于發酵劑中菌種差異、數量及其混合比例差異造成。2 號和3 號發酵劑具有良好的抗氧化功能。添加嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901 的發酵劑比未添加嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901 的發酵劑具有優良的發酵性能，可用于直投式發酵劑的開發。由于酸奶具有豐富的營養和良好的保健功能在我國有著很大的市場[20-21]，需求量也日益增加。但是就目前而言，國外企業酸奶發酵劑市場長期處于壟斷地位，為了更好地促進國內酸奶產業發展，開發我國自己的直投式發酵劑勢在必行[22-24]。因而，開發具有優良品質的功能性直投式發酵劑是必要的。