吳燕，伏二偉，桑學(xué)財(cái)，馬曉軍

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

漿水菜是我國(guó)陜西、甘肅、山西、河南等地的一種傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜[1]。傳統(tǒng)做法一般采用面粉和蔬菜為原料，加入漿水引子后，經(jīng)其中的多種微生物菌群發(fā)酵而成。其氣味清香、口味酸醇，且含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，具有諸多的益生功效[2]，如：調(diào)理腸胃、提高食欲、消暑止渴等。一般情況下，漿水發(fā)酵過(guò)程需要經(jīng)過(guò)初、中、后期3 個(gè)階段，每個(gè)階段均包含著復(fù)雜的微生物群系，但其中最主要的發(fā)酵菌群為乳酸菌[1]。張勇等[3]對(duì)陜西傳統(tǒng)發(fā)酵漿水中的微生物群系進(jìn)行探究并從中分離鑒定出18 株乳酸菌。李雪萍[4]從西北不同的5 個(gè)地區(qū)的漿水樣品中共分離純化得到107 株菌，并對(duì)所分離菌種進(jìn)行鑒定、分析其多樣性。張曉輝等[5]對(duì)3 個(gè)不同地方采集的漿水中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，得知乳桿菌在3 種漿水中為優(yōu)勢(shì)菌，且3 種漿水中的細(xì)菌多樣性存在差異。

隨著對(duì)乳酸菌研究的不斷深入，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)其不僅具有調(diào)整胃腸道菌群平衡、提高食物消化率的功效[6]，還能夠有效降低腸道的膽固醇含量、改善腸道環(huán)境[7-8]，因此被廣泛用于發(fā)酵食品的加工過(guò)程，來(lái)抑制食品中腐敗菌的生長(zhǎng)、延長(zhǎng)貨架期、提高食品的品質(zhì)及風(fēng)味[6]。且乳酸菌大多可以產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，具有抗菌活性，因此被廣泛用于發(fā)酵食品的加工過(guò)程，抑制食品中腐敗菌的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)貨架期，并對(duì)食品的品質(zhì)及風(fēng)味進(jìn)行改善[9-10]。雖然近年來(lái)我國(guó)科研人員對(duì)漿水這一傳統(tǒng)發(fā)酵食品的研究逐漸深入，但主要集中于對(duì)其菌群情況的研究，對(duì)漿水中乳酸菌抑菌性能的研究并不多見(jiàn)。

本研究以甘肅天水周邊為采樣地點(diǎn)，從傳統(tǒng)發(fā)酵漿水中提取具有抑菌活性的乳酸菌株，并篩選出產(chǎn)蛋白質(zhì)類(lèi)細(xì)菌素的乳酸菌，觀察并研究其形態(tài)、生長(zhǎng)特性，進(jìn)行乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定。為之后提純抑菌成分、開(kāi)發(fā)新型抑菌制劑及發(fā)酵食品提供借鑒和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漿水來(lái)自農(nóng)家自制及市售；MRS 肉湯培養(yǎng)基、MRS 瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）標(biāo)準(zhǔn)菌株由江南大學(xué)谷物與淀粉研究中心實(shí)驗(yàn)室保存；木瓜蛋白酶（酶活力600 U/mg）、蛋白酶K（酶活力 30 U/mg）、胰蛋白酶（酶活力 10 U/mg）、胃蛋白酶（酶活力3 U/mg）、過(guò)氧化氫酶（酶活力200 U/mg）：TaKaRa 公司；草酸銨結(jié)晶紫染色液、盧氏碘液、番紅復(fù)染液：江南大學(xué)谷物與淀粉研究中心實(shí)驗(yàn)室自配。

1.2 儀器與設(shè)備

BCD-208BSC 冰箱：青島海爾股份有限公司；YXJ-2 臺(tái)式離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ZA100R3 電子天平：上海贊維衡器有限公司；SW-CJ-1F 超凈工作臺(tái)：蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司；HZQ-X100A 電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；U-3010 紫外分光光度計(jì)：Hitachi 公司；Zeiss AxioVert.A1 熒光倒置顯微鏡：蔡司中國(guó)；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌富集培養(yǎng)

向MRS 液體培養(yǎng)基中加入適量漿水樣品，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48 h。

1.3.2 乳酸菌的分離純化

用無(wú)菌生理鹽水對(duì)富集培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尪葹?0-1～10-7。采用稀釋混勻平板法，分別吸取0.1 mL 稀釋度為 10-4、10-5、10-6、10-7的菌懸液注入培養(yǎng)皿，將50 ℃左右的碳酸鈣MRS 瓊脂培養(yǎng)基倒入皿中，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，將其轉(zhuǎn)移至37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。篩選鈣溶圈較大的菌落，在MRS 固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化、鏡檢，得到純菌落。將純化菌株接種于MRS 斜面培養(yǎng)基中，繼續(xù)于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后保存于4 ℃低溫冰箱中。

1.3.3 乳酸菌的形態(tài)學(xué)觀察

菌落形態(tài)：采用平板劃線法，將純化的乳酸菌劃線于MRS 固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察并記錄菌落顏色和外形特征。

菌體形態(tài)：取培養(yǎng)24 h 的乳酸菌體進(jìn)行革蘭氏染色、制片，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果及乳酸菌形態(tài)。

1.3.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

按2 %的接種量將預(yù)先活化好的乳酸菌液加入MRS 培養(yǎng)液中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。每隔2 h 取發(fā)酵液，以未接菌的MRS 液體培養(yǎng)基作對(duì)照，在600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值（OD600nm），平行測(cè)定3 次，繪制各菌株生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 pH 值的測(cè)定

采用pH 計(jì)測(cè)定。將預(yù)先活化好的乳酸菌按2%的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，每隔2 h 測(cè)定發(fā)酵液的pH 值，平行測(cè)定3 次。

1.3.6 耐酸試驗(yàn)

參考王俊國(guó)[11]的方法，制備人工胃液：取稀鹽酸16.4 mL，加 800 mL 水、10 g 胃蛋白酶，搖勻后加水至1 000 mL，用0.23 μm 的無(wú)菌濾頭在無(wú)菌操作臺(tái)中除菌過(guò)濾待用，于無(wú)菌試劑瓶中低溫保藏備用。取活化好的菌株培養(yǎng)液5 mL，4 000 r/min 離心10 min 后棄上清，向菌體中加入5 mL 無(wú)菌生理鹽水，混勻制成菌懸液，取1.0 mL 菌懸液與9.0 mL pH3.0 的人工胃液混合后，置 37 ℃培養(yǎng)，于 0 h、3 h 取樣，采用平板計(jì)數(shù)法，用MRS 固體培養(yǎng)基傾注，于37 ℃培養(yǎng)48 h 后計(jì)活菌數(shù)，按公式（1）計(jì)算存活率。

式中：A 為 3 h 的活菌數(shù)，CFU/mL；B 為 0 h 的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.7 耐膽鹽試驗(yàn)

選取在耐酸試驗(yàn)中存活率大于10%的乳酸菌進(jìn)行膽鹽耐受性試驗(yàn)[11]。在含0.10%牛膽鹽、0.30%牛膽鹽）的MRS-THIO 培養(yǎng)基中添加2%的活化好的乳酸菌液，置37 ℃培養(yǎng)，于0、3 h 取樣，采用和耐酸性試驗(yàn)相同的方法，按公式（1）計(jì)算存活率（%）。

1.3.8 抑菌試驗(yàn)

1.3.8.1 指示菌菌懸液的制備

將指示菌金黃色葡萄球菌接種到MRS 液體培養(yǎng)基中，將枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌接種到普通肉湯培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)24 h，離心，配制菌懸液。采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)量菌懸液的菌含量，取菌液濃度105CFU/mL 的菌液作為指示菌懸液。

1.3.8.2 乳酸菌代謝產(chǎn)物的制備

將半固體保存的菌株接種到MRS 液體培養(yǎng)基內(nèi)傳兩代培養(yǎng)。取第3 代培養(yǎng)液，4 000 r/min 離心15 min，收集上清液，經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾制成無(wú)菌濾液，所得無(wú)菌濾液即為乳酸菌的代謝產(chǎn)物。

1.3.8.3 乳酸菌代謝產(chǎn)物抑菌試驗(yàn)

使用牛津杯法測(cè)定抑菌圈大小[12]，指示菌分別為蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌（105CFU/mL）。

1.3.8.4 代謝產(chǎn)物酸堿處理后的抑菌效果

用1 mol/L 的 NaOH、HCl 將代謝產(chǎn)物的 pH 值分別調(diào)至 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，采用1.3.8.3 中提到的方法測(cè)定抑菌圈大小，指示菌為蠟狀芽孢桿菌。用乳酸溶液、1 mol/L 的NaOH 將MRS 液體培養(yǎng)基的 pH 值調(diào)至 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 做對(duì)照試驗(yàn)。

1.3.8.5 代謝產(chǎn)物熱處理后的抑菌效果

將代謝產(chǎn)物在沸水浴中處理30 min，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，用未處理的代謝產(chǎn)物作對(duì)照組。

1.3.8.6 代謝產(chǎn)物酶處理后的抑菌效果

取 1 mL 的代謝產(chǎn)物，用 1 mol/L 的 NaOH、HCl 將代謝產(chǎn)物的pH 值分別調(diào)至各酶最適范圍，加入蛋白酶 K（0.5 mg/mL）、胃蛋白酶（0.5 mg/mL）、胰蛋白酶（0.5 mg/mL）、木瓜蛋白酶（0.5 mg/mL）、過(guò)氧化氫酶（0.5 mg/mL）適量，于37 ℃水浴2 h，然后調(diào)代謝產(chǎn)物pH 值至初始值，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，使用未經(jīng)酶處理的代謝產(chǎn)物作對(duì)照組。

1.3.9 乳酸菌菌株的鑒定

1.3.9.1 提取DNA

乳酸菌的基因組DNA 的提取采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammoniumbromide，CTAB）法[13]。

1.3.9.2 乳酸菌16SrDNA 的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增與測(cè)序

擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 4 min、94 ℃變性 45 s、56 ℃退火 1 min、72 ℃延伸 1 min，30 個(gè)循環(huán)、72 ℃延伸10 min[14-15]；模板：乳酸菌菌株基因組 DNA；引物：27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和 1495r（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA）[16]。

擴(kuò)增程序完成后，對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)驗(yàn)證，之后純化目標(biāo)條帶并送至上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。

1.3.9.3 同源性分析

使用核酸基于局部比對(duì)算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）技術(shù)，將上一步測(cè)得的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物序列對(duì)比NCBI 網(wǎng)站里的GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列信息，檢索得到與所測(cè)序列同源性最高的已知分類(lèi)地位的菌種。

1.3.9.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS22 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化及形態(tài)學(xué)觀察

從傳統(tǒng)發(fā)酵漿水中分離出乳酸菌6 株。革蘭氏染色特性、菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)是細(xì)菌種屬鑒定的重要依據(jù)，不同的細(xì)菌種屬會(huì)得到不同的革蘭氏染色結(jié)果，且其在培養(yǎng)基表面呈現(xiàn)出的菌落形態(tài)及顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)也不同。本研究純化后得到的菌株的菌落形態(tài)及革蘭氏染色特性如表1 所示。

表1 漿水樣品中分離出的各乳酸菌的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果Table 1 Colony morphology and Gram staining results of each lactic acid bacteria isolated from Jiangshui celery

從表1 可以看出，傳統(tǒng)發(fā)酵漿水中分離純化得到的乳酸菌菌落均呈圓形、白色，表面多光滑濕潤(rùn)。革蘭氏染色觀察，發(fā)現(xiàn)菌株均呈桿狀，為長(zhǎng)桿狀或短桿狀，與武帥帥、李良鳳等在漿水菜中觀察到的可培養(yǎng)乳酸菌的菌體形態(tài)相似[17-18]。圖1 為菌株SJ-3 的顯微圖像。

圖1 菌株SJ-3 的革蘭氏染色（×1000）Fig.1 Gram staining of strain SJ-3（×1000）

2.2 乳酸菌的生物學(xué)特性

2.2.1 乳酸菌的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸能力

6 株乳酸菌的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 6 株乳酸菌的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of 6 strains

由圖2 可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，6 株菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)相似。0～6 h SJ-3 處于遲滯期，其他5 株乳酸菌在0～4 h 處于遲滯期；SJ-1、SJ-5 在 4 h～16 h 處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，SJ-2、SJ-6 在 4 h～14 h 為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，SJ-3、SJ-4分別在 6 h～20 h 和 4 h～18 h 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。SJ-2、SJ-6 于 14 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期，SJ-1、SJ-5 在 16 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期，SJ-3、SJ-4 則分別在 20 h 和 18 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期。在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，菌株SJ-4 的菌液濃度最大、繁殖能力最強(qiáng)，其次為菌株SJ-5、SJ-6，而菌株SJ-3 的生長(zhǎng)速率明顯較慢。

6 株乳酸菌的pH 值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 6 株乳酸菌的pH 值曲線Fig.3 pH value curves of 6 strains

由圖 3 可以看出，菌株 SJ-1、SJ-2、SJ-3、SJ-4、SJ-5 培養(yǎng)液的 pH 值在 2 h～14 h 內(nèi)迅速下降，SJ-6 培養(yǎng)液的pH 值在8 h～16 h 內(nèi)迅速下降，隨后pH 值下降緩慢直至趨于平穩(wěn)，最終pH 值分別達(dá)到3.50、3.78、3.86、3.68、3.71。綜合比較發(fā)現(xiàn)，六株乳酸菌中 SJ-1 的產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。

2.2.2 乳酸菌的耐酸耐膽鹽能力

6 株乳酸菌的耐酸能力見(jiàn)圖4。

圖4 6 株乳酸菌的耐酸能力Fig.4 Acid resistance of 6 strains

6 株乳酸菌都能耐受pH3.0 的人工胃液，其中SJ-3、SJ-5 的存活率在 50 %以上，SJ-2、SJ-3、SJ-5、SJ-6的存活率在30 %以上，除SJ-4 以外，其他菌株的存活率都在10 %以上，其中SJ-5 的存活率最大，可達(dá)75%。選擇在pH3.0 人工胃液中存活率在10%以上的5 株乳酸菌做不同膽鹽濃度下的生長(zhǎng)測(cè)試。

5 株乳酸菌的耐膽鹽能力見(jiàn)圖5。

圖5 5 株乳酸菌的耐膽鹽能力Fig.5 Bile resistance of 5 strains

由圖5 可知，5 株乳桿菌對(duì)0.1%膽鹽有一定的耐受力，除SJ-6 的存活率僅有0.21%，其他4 株菌的存活率均在70%以上。當(dāng)膽鹽濃度升高至0.3%時(shí)，乳酸菌的存活率明顯降低，SJ-1、SJ-2、SJ-3 的存活率分別只有1.00%、0.01%和0.88%。

2.3 具有抑菌活性乳酸菌的篩選

牛津杯法測(cè)定抑菌圈大小見(jiàn)圖6，6 株乳酸菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性結(jié)果如表2 所示。

從表2 可以看出，6 株乳酸菌的代謝產(chǎn)物的抑菌效果。從表2 可知，6 株乳酸菌對(duì)指示菌均顯示了抗菌活性。對(duì)蠟狀芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，SJ-1 顯示了較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌圈直徑分別約為24.2、17.3 mm；SJ-3 對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑約為10.4 mm，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性；SJ-6 相比其他5 個(gè)菌株對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性顯著更高，抑菌圈直徑約為13.8 mm。對(duì)表2 中的結(jié)果進(jìn)行綜合分析可知，SJ-6 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑是最大的，SJ-1 和SJ-6 對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑也沒(méi)有顯著差異，因此SJ-6 抑菌效果更好。

圖6 牛津杯法測(cè)定抑菌圈大小Fig.6 Determination of the size of the zone of inhibition by the Oxford cup method

表2 乳酸菌代謝產(chǎn)物的抑菌圈直徑Table 2 Dialysis zone diameters of lactic acid bacteria metabolites mm

2.4 代謝產(chǎn)物酸堿處理后的抑菌活性測(cè)定

以蠟狀芽孢桿菌為指示菌，不同pH 值代謝產(chǎn)物的抑菌活性見(jiàn)表3。

表3 乳酸菌代謝產(chǎn)物調(diào)不同pH 值后的抑菌圈直徑Table 3 Dialysis zone diameters of lactic acid bacteria metabolites adjusted to different pH value mm

分析表3 數(shù)據(jù)可知，pH 值大小會(huì)對(duì)乳酸菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性產(chǎn)生顯著影響。當(dāng)pH 值小于7 時(shí)，代謝產(chǎn)物抑菌活性隨pH 值的升高而降低，當(dāng)pH 值為2.0、3.0、4.0 時(shí)，6 株乳酸菌的代謝產(chǎn)物均對(duì)蠟狀芽孢桿菌表現(xiàn)出有抑菌活性，當(dāng) pH 值升高至5 時(shí)，SJ-3、SJ-4、SJ-5、SJ-6 與對(duì)照組的乳酸均失去抑菌活性，只有SJ-1、SJ-2 的代謝產(chǎn)物仍保持抑菌活性。

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，SJ-3、SJ-4、SJ-5、SJ-6 這 4株菌代謝產(chǎn)物中包含有機(jī)酸類(lèi)抑菌成分，或可能含有依賴(lài)有機(jī)酸產(chǎn)生抑菌作用的其他成分。而SJ-1、SJ-2代謝產(chǎn)物中除有機(jī)酸外仍含其他抑菌成分。

以蠟狀芽孢桿菌為指示菌，SJ-1、SJ-2 代謝產(chǎn)物在100 ℃下保持30 min 的抑菌活性見(jiàn)表4。

2.5 代謝產(chǎn)物熱處理后的抑菌活性測(cè)定

表4 乳酸菌代謝產(chǎn)物熱處理后的抑菌圈直徑Table 4 Dialysis zone diameters of lactic acid bacteria metabolites after heat treatment mm

分析比較表4 數(shù)據(jù)可知，代謝產(chǎn)物在沸水浴中處理30 min 后，SJ-1、SJ-2 菌株的抑菌圈大小沒(méi)有發(fā)生明顯的改變，表明熱處理不會(huì)對(duì)其抑菌活性產(chǎn)生影響，抑菌成分具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.6 代謝產(chǎn)物酶處理后的抑菌活性測(cè)定

以蠟狀芽孢桿菌為指示菌，酶處理后的菌株SJ-1、SJ-2 代謝產(chǎn)物抑菌活性如表5 所示。

表5 乳酸菌代謝產(chǎn)物酶處理后的抑菌圈直徑Table 5 Dialysis zone diameters of lactic acid bacteria metabolites after enzyme treatment mm

從表5 可以看出，經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理后，菌株SJ-1、SJ-2 代謝產(chǎn)物抑菌活性分別降低了12%和29%，說(shuō)明代謝產(chǎn)物中包含過(guò)氧化氫作為抑菌成分；排除過(guò)氧化氫的干擾后，代謝產(chǎn)物仍具有抑菌活性，因此判定代謝產(chǎn)物中還含有其他成分的抑菌物質(zhì)。代謝產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶K 處理后，抑菌活性分別降低了31%、43%；胃蛋白酶處理后分別降低了14%、40%；木瓜蛋白酶處理后分別降低了15%、30%；胰蛋白酶處理后降低了13%、35%。說(shuō)明菌株代謝產(chǎn)物中的抑菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶敏感，所以極有可能是一種蛋白類(lèi)抑菌物質(zhì)。

2.7 乳酸菌16SrDNA 序列分析

對(duì)乳酸菌SJ-1、SJ-2 進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、提取基因組DNA、擴(kuò)增16SrDNA 保守序列，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，驗(yàn)證得兩菌株的保守序列大小相同，約為1 500 bp，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 來(lái)源于漿水樣品的2 株乳酸菌的16SrDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.7 16SrDNA amplification products of 2 strains of lactic acid bacteria derived from Jiangshui celery

將測(cè)得的2 株菌的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物序列與NCBI 在線數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SJ-1 與發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）的16SrDNA 的相似性達(dá)100%、SJ-2 與的植物乳桿菌（Lactococcus plantarum）16SrDNA 的相似性達(dá)99%，表6 即為基因序列的比對(duì)結(jié)果。

表6 分離菌株16SrDNA 基因序列與GenBank 已知菌序列的相似性比較Table 6 Comparison of similarity between 16SrDNA gene sequences of isolated strains and known sequences of GenBank

3 結(jié)論與討論

本研究從漿水中分離出6 株乳酸菌，觀察其形態(tài)特征，研究其生長(zhǎng)曲線、產(chǎn)酸能力、耐酸耐膽鹽能力，并從中篩選具抑菌活性的菌株。結(jié)果表明：分離純化得到的乳酸菌菌落均呈圓形、白色、表面多光滑濕潤(rùn)，呈革蘭氏陽(yáng)性，在顯微觀察下菌體呈長(zhǎng)桿狀或短桿狀。在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，菌株SJ-4 的繁殖能力最強(qiáng)；菌株SJ-1 最終pH 值最低，產(chǎn)酸能力最強(qiáng)；菌株SJ-3、SJ-5表現(xiàn)出較好的耐酸能力，大部分的菌株對(duì)0.1%的膽鹽表現(xiàn)出較好的耐受力，但當(dāng)膽鹽濃度升至0.3%，乳酸菌存活率大幅下降。菌株SJ-1、SJ-2 代謝產(chǎn)物排除酸抑制作用和過(guò)氧化氫抑制作用及熱處理后依然維持較高的抑菌活性，而經(jīng)蛋白酶處理后，抑菌活性明顯降低。表明其中存在一種蛋白質(zhì)類(lèi)的抑菌物質(zhì)。對(duì)菌株SJ-1、SJ-2 進(jìn)行16SrDNA 分子生物學(xué)鑒定，菌株SJ-1 屬于發(fā)酵乳桿菌屬（Lactobacillus fermentum strain）、SJ-2 屬于植物乳桿菌屬 （Lactobacillus plantarum strain）。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有不少關(guān)于產(chǎn)蛋白質(zhì)類(lèi)抑菌物質(zhì)乳酸菌的研究報(bào)道，如LGG（Lactobacillus rhamnosus GG）、ZJ19[19]和 KCA386[20]，對(duì)李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌和多數(shù)乳酸菌有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)從甘肅傳統(tǒng)漿水中篩選出2 株具有抑菌活性的乳酸菌，探究了其抑菌菌株 SJ-1（Lactobacillus fermentum strain）、SJ-2（Lactobacillus plantarum strain）產(chǎn)生的蛋白類(lèi)抑菌物質(zhì)，能對(duì)常見(jiàn)的金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌等致病菌、腐敗菌產(chǎn)生抑制效果，使其有可能作為病原微生物與食物腐敗菌的天然屏障[21]并廣泛應(yīng)用到食品防腐保鮮加工業(yè)中。后續(xù)需要繼續(xù)分離純化菌株SJ-1、SJ-2 所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)，并充分評(píng)估其生物學(xué)活性和安全性，以期能夠開(kāi)發(fā)出新型的天然防腐劑。