楮實多糖對小鼠抗疲勞作用的研究

王麗敏，舒適，楊娟，*

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽550014）

楮樹（Broussonetia papyrifera），又名構樹，為灌木類桑科構屬植物，雌雄異株[1]。楮實子為構樹的干燥成熟果實，資源豐富，具有悠久的藥用歷史，我國藥典有收載。楮實子（Fructus Broussonetiae）始載于漢代《名醫別錄》，味甘性寒無毒，具有滋腎益陰、利水消腫的功效；周峰等研究顯示楮實子含有豐富的氨基酸、脂肪酸、生物堿、多糖等化學成分[2]，龐素秋對中藥楮實子的抗衰老活性成分進行了研究，闡述了楮實子補腎作用機理及其抗衰老的物質基礎與分子機理[3]。楮桃即構樹果實，其果汁中含有大量營養物質，其中可溶性糖和生理活性物質類黃酮的含量較高，且含有較多的維生素和可溶性蛋白質及多種礦質元素。有研究以楮實為主要原料，經過最佳的發酵工藝，研制出一款營養豐富、酸甜爽口、風味獨特的果酒，這種果酒也是一種新型營養保健飲品[4]。周文美等以新鮮楮桃和番茄為主要原料，通過酒精發酵和醋酸發酵，制作出楮桃和番茄復合型果醋，并對其生產工藝和工藝參數進行了研究[5]。

目前對楮實的研究甚少，文獻多為歷代本草記載的有關中醫學理論的綜述性文章，關于楮實多糖的研究更是寥寥少數。因此本文充分利用傳統中藥資源楮實，從中提取得到楮實多糖，并進一步對其抗疲勞作用進行考察，將有利于傳統中藥楮實活性成分及營養保健機理的深入研究，對楮實資源的開發利用奠定前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

楮實鮮果，采自貴州省貴陽市藥用植物園內，經貴陽中醫學院孫慶文教授鑒定為桑科構屬植物構樹Broussonetia papyrifera（Linn.）Vent 聚花果。

昆明種小鼠，雌雄各半，6 周～8 周齡，體重（20±2）g，貴州醫科大學實驗動物中心提供。肌糖原及肝糖原測定試劑盒、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）測試盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測試盒：南京建成生物工程研究所。

游泳箱（大小約 50 cm×50 cm×40 cm）[6]、BUCHIR220 旋轉蒸發儀：Switzerland 公司；HP-8453 紫外可見分光光度儀：惠普公司；DZ-2BC 真空干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；TDL-40C 低速臺式離心機、TGL-16B 高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 楮實粗多糖（crude polysaccharide from Broussonetia papyrifera，CS）制備

參考響應面分析法優化楮實多糖提取工藝[7]，楮實鮮果經60 ℃真空干燥后粉碎過80 目篩，用80%乙醇提取2 h，提取至提取液顏色變為淡黃色為止，抽濾得固體粉末，再經60 ℃真空干燥制得楮實粉備用。取楮實粉置于圓底燒瓶中，按料液比1 ∶10（g/mL）加入蒸餾水至提取罐中，沸水浴提取2 h。提取液室溫（37 ℃左右）冷卻過濾，合并濾液，濃縮冷卻至室溫（37 ℃左右），經 4 000 r/min 離心 15 min，重復提取 3 次后，提取液合并，上清液減壓濃縮至一定體積后，加入95%乙醇進行醇沉，終濃度不低于80%。所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮洗滌，真空干燥得粗多糖。參考苯酚-硫酸法對慈姑多糖含量的測定[8]，制作葡萄糖標準曲線以及測定樣品中多糖的含量。

1.2.2 楮實多糖的抗疲勞活性研究

1.2.2.1 動物分組及給藥劑量

取健康小鼠120 只，雌雄各半，按體質量隨機分為空白對照組，楮實多糖低劑量組（CS-L）、中劑量組（CS-M）、高劑量組（CS-H）3 個劑量組。每組 30 只，自由攝食和飲水，給藥劑量為：20、50、80 mg/（kg·d）；空白組給予等體積生理鹽水。每天根據小鼠體重定時灌胃給藥（按 0.1 mL/10 g），飼養溫度（20±3）℃，濕度（55±6）%。

1.2.2.2 小鼠疲勞模型的建立

小鼠在（30±2）℃水中不負重游泳60 min 造成疲勞，游泳停止后90 min 和150 min，每組隨機抽取10 只小鼠取肌肉、肝臟和血清樣品測定肌糖原、肝糖原、乳酸脫氫酶和血尿素等指標[9-11]。

1.2.2.3 肌糖原和肝糖原含量的測定

小鼠經脫頸椎處死后立即取新鮮肝臟和肌肉樣本用生理鹽水漂洗后，濾紙吸干，稱重（質量≤100 mg）。按照樣本質量（mg）∶堿液體積（μL）=1 ∶3，一起加入試管中，沸水浴煮20 min，流水冷卻，使樣品水解。加蒸餾水配制成糖原檢測液，肝糖原測定的蒸餾水添加量（mL）為肝重的96 倍，肌糖原測定的蒸餾水添加量（mL）為肌肉的16 倍。按照試劑盒的說明，進行肌糖原和肝糖原含量的測定。

1.2.2.4 乳酸脫氫酶活力的測定

小鼠斷頭取血，室溫（37 ℃左右）下放置30 min后，4 000 r/min 離心10 min 得上層透明液為小鼠血清。按照試劑盒的說明，進行乳酸脫氫酶活力的測定。

1.2.2.5 尿素氮含量測定

樣品操作同1.2.2.4。

1.3 數據分析

應用SPSS 17.0 軟件進行統計分析，結果均以均數±標準偏差表示，并進行ANOVA 分析，多重比較采用 Dunnet’s 法，P＜0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 楮實多糖含量測定

以葡萄糖含量為橫坐標，其相應的吸收值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，得回歸方程為：y=6.348 5x+0.015 7，式中：x 為葡萄糖含量，mg；y 為吸光度），相關系數R2=0.997 9。取楮實多糖樣品液，于波長490 nm處測定吸光度值，代入回歸方程，計算其多糖含量為6.03 mg/g。

2.2 楮實多糖對糖原含量的影響

肝糖和肌糖是機體內貯存糖原的主要方式，在運動過程，肌肉對肌糖原的需求增加，肝糖原快速分解，釋放葡萄糖快速入血，維持機體血糖以滿足運動肌肉對糖的需求，且肌糖原和肝糖原對維持機體運動的耐力較重要[12]。小鼠運動前后肌糖原含量、肝糖原含量、肌糖原儲備增長率及恢復率的變化見表1～表3。

表1 小鼠運動前后肌糖原含量的變化Table 1 Changes in muscle glycogen contents before and after exercise in mice

表2 小鼠運動前后肝糖原含量的變化Table 2 Changes of liver glycogen contents before and after exercise in mice

表3 運動前后小鼠肌糖原儲備增長率及恢復率變化Table 3 Changes in muscle glycogen reserve growth and recovery rate in mice before and after exercise

由表1～3 可知，在肌糖原和肝糖原含量的變化中，靜息時CS3 個劑量組20、50、80 mg/（kg·d）與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；運動后3 個劑量組的糖原含量仍顯著高于對照組，其中50 mg/kg·d 劑量組的糖元儲備增長率和恢復率要明顯好于其他組。說明楮實多糖能增加糖原儲備，為機體提供更多能源物質。

肌糖原、肝糖原和血糖是機體內的三大糖儲備。當糖原耗竭，將會影響運動的持久力，因此肌糖原含量可作為反映疲勞程度的重要指標[13]。由表3 可知，楮實多糖低、中、高劑量均能夠增加小鼠肝糖原和肌糖原的恢復率，其中肌糖元儲備增長率分別為33.18%、39.49%、23.84%，且中劑量組效果比較好。

2.3 楮實多糖對乳酸脫氫酶活力的影響

乳酸脫氫酶是糖無氧酵解及糖異生的重要酶系之一，它能將機體劇烈運動產生并堆積在肌肉中的乳酸轉化為丙酮酸，減少乳酸在肌肉中的堆積。不同給藥劑量對LDH 活力的影響見表4。

表4 小鼠運動前后乳酸脫氫酶活力變化Table 4 Changes of lactate dehydrogenase activity before and after exercise in mice

游泳前各給藥組的LDH 活力明顯高于對照組，游泳后90 min 的LDH 活力高于游泳前，游泳后150 min相比游泳后90 min 的LDH 活力有所下降，但仍略高于對照組，存在顯著差異（P＜0.05），其中以50 mg/（kg·d）劑量組為最佳。說明楮實多糖能提高乳酸脫氫酶活力，可以加速肌肉中過多乳酸的清除，達到減緩疲勞和加速疲勞恢復的作用[14]。

2.4 楮實多糖對小鼠血尿氮含量的影響

尿素氮是體內氨基酸分解代謝的最終產物之一，機體血清尿素氮含量隨運動負荷的增加而增加。由表5 和表 6 所示。

表5 小鼠運動前后血尿素氮含量變化Table 5 Changes of blood urea nitrogen before and after exercise in mice

小鼠在靜息時給藥組體內尿素氮含量明顯小于對照組，運動后血尿素含量升高，各給藥組運動后血尿氮增加量均顯著小于對照組。各給藥組對血尿素的清除速率均顯著大于對照組，其中以50 mg/kg·d 效果為最好，清除速率達到25.67%，清除速率值越大抗疲勞效果越好。當給藥劑量增加至80 mg/kg·d 時，抗疲勞效果并無顯著差異。從血尿氮的增量來看，各劑量組的增量都小于對照組，表明楮實多糖能夠抑制或減少疲勞小鼠血清尿素氮的產生，提高小鼠的抗疲勞能力。

表6 各劑量對清除速率和小鼠運動后血尿氮增量的影響Table 6 Effects of different doses on clearance rate and blood urine nitrogen increment after exercise in mice

3 結論

疲勞是機體復雜的生理生化變化過程，引起身體與精神狀態的下降，進而導致工作能力及工作效率的衰退，肝糖原、血清尿素氮及其乳酸含量通常作為檢測疲勞的生化指標[15]。肝糖原的主要作用是維持血糖的相對穩定，隨著運動時間的延長，血糖水平開始下降，肝糖原分解作用增加，一旦肝糖原分解耗竭，會使運動肌功能不足，導致外周疲勞[16-17]。本研究表明楮實抗疲勞作用可能與增加肝糖原的儲備有關。當機體長時間運動，不能得到肝糖原分解代謝產生的足夠能量時，機體蛋白質與氨基酸分解，產生大量尿素氮。機體尿素氮含量隨運動負荷增加而增加，機體對負荷的適應能力越差，血清尿素氮的增加就越明顯。在實驗中3 個多糖劑量組對血尿素的清除速率均顯著大于對照組，其中以50 mg（/kg·d）效果為最好，清除速率達到25.67%，且多糖劑量組的血尿氮增量低于對照組，說明楮實多糖能夠抑制或減少疲勞小鼠血清尿素氮的產生，提高小鼠的抗疲勞能力。

楮實粗多糖的20、50、80 mg（/kg·d）劑量組均能顯示出具有提高小鼠在運動前后體內肌糖原和肝糖原儲備量、乳酸脫氫酶活力及降低血尿氮含量的功效，發現楮實多糖對小鼠有明顯的抗疲勞作用，在本實驗條件下，小鼠抗疲勞作用與多糖濃度表現出一定的量效關系，隨著給藥劑量增加，其作用增強，其中50 mg（/kg·d）劑量抗疲勞效果最好，繼續增大給藥量其抗疲勞結果無顯著差異。