高效液相色譜-串聯質譜法同時測定兒童彩泥類造型玩具中3種異噻唑啉酮類防腐劑

王 瑾，任潔芳，張東雷，周 敏，李祖光，張慧敏

(1.浙江省產品質量安全檢測研究院，浙江 杭州 310018;2.浙江工業大學 化學工程學院，浙江 杭州 310014)

異噻唑啉酮類化合物是一種廣譜、高效、非氧化性殺菌防腐劑，該化合物穩定性強、使用成本低，廣泛應用于玩具、紡織品、造紙、皮革、涂料、化妝品等行業[1-5]，其中常見的有2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MI)、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(CMI)和1,2-苯并異噻唑啉-3-酮(BIT)等。研究表明，該類物質是一類致敏劑，可能引起過敏或皮炎等反應，過量接觸還可導致皮膚灼傷，其中以MI和CMI的致敏性和刺激性最強[6-7]。國內外對食品接觸材料、化妝品、玩具等日用品中異噻唑啉酮類防腐劑的使用制定了嚴格的法規標準。歐盟玩具協調標準EN 71-9-2005[8]中明確限定了MI、CMI和BIT在玩具皮革、玩具中的液體、造型粘土及類似物等玩具材料中的限量分別為10、10、5 mg/kg，且MI和CMI的總限量為15 mg/kg。

目前，異噻唑啉酮類物質的檢測方法主要有分光光度法[9]、氣相色譜法[10]、氣相色譜-質譜聯用法[11-13]、液相色譜[14-15]和LC-MS/MS[16-18]等。歐盟玩具協調標準EN 71-10[19]和EN 71-11[20]分別詳細說明了異噻唑啉酮類化合物的提取和測定方法，以去離子水萃取玩具材料中的目標物后，采用液相色譜-紫外檢測進行測定，但該方法靈敏度低，方法定量下限即為限量要求，且易出現假陽性，無法滿足檢測需求。而LC-MS/MS因分析時間短、選擇性好、靈敏度高，更適用于復雜體系中高沸點或熱穩定性差等物質的測定，同時隨著色譜技術的不斷發展，儀器普及率也較高，樣品預處理也相對簡單。然而，應用HPLC-MS/MS測定彩泥類造型玩具中異噻唑啉酮類物質的檢測未見報道。因此，本文建立了一套簡單、快速、準確測定兒童彩泥類造型玩具中異噻唑啉酮類物質的HPLC-MS/MS分析方法，該方法可滿足歐盟玩具標準的相關限量要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

QTRAP?5500三重四極桿串聯質譜儀(美國AB公司)，LC-20ADXR高效液相色譜儀(日本島津公司)，Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)，臺式高速離心機(Sigma公司)，渦旋振蕩器(IKA公司)，超聲波清潔器(上?？茖Ч?，電子天平(梅特勒-托利多公司)。

標準品：MI(純度97.01%)，CMI(純度98.51%)，BIT(純度99.58%)，均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

甲醇(色譜純，Merck 公司)，乙酸銨(色譜級，≥99.0%，Aladdin公司)，實驗用水均符合GB/T 6682-2008[21]的實驗室一級用水。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備液：分別準確稱取10.0 mg(精確至0.1 mg)MI、CMI、BIT標準品于10 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，配制成1 000 mg/L單標儲備液，于-18 ℃棕色玻璃瓶中保存。

混合標準中間液：分別準確移取1 000 mg/L單標儲備液100 μL于10 mL容量瓶，甲醇稀釋定容，得10 mg/L混合標準溶液，于4 ℃棕色玻璃瓶中保存；再將10 mg/L混合標準溶液用甲醇稀釋至1 mg/L，得1 mg/L混合標準溶液，現配現用。

空白基質提取液：樣品按照“1.3”條件進行前處理和儀器分析，確定樣品為陰性樣品，其提取液可作為空白基質提取液。

溶劑混合標準溶液的配制：準確吸取1 mg/L混合標準溶液，以甲醇-水(1∶1，體積比)稀釋，配制成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列混合標準工作溶液。

基質混合標準溶液的配制：準確吸取1 mg/L混合標準溶液，以空白基質提取液稀釋，配制成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列基質混合標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

準確稱取0.50 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL聚丙烯離心管內，加入15.0 mL甲醇，超聲提取30 min，8 000 r/min離心5 min，準確移取上清液1.0 mL，用水1∶1稀釋，渦旋混勻后過0.22 μm有機濾膜，上機測定。

若按上述前處理過程，提取液中分析物濃度超出方法的線性范圍時，則需用甲醇-水(1∶1，體積比)進行必要的稀釋處理。

1.4 LC-MS/MS條件

液相色譜條件：色譜柱Kinetex?C18柱(100 mm×3 mm，2.6 μm)；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL；流速：300 μL/min；流動相：A為甲醇，B為水，梯度洗脫：0～2.0 min，20%A；2.0～4.0 min，20%～80%A；4.0～8.0 min，80%A；8.0～9.0 min，80%～20%A；9.0～10.0 min,20%A。

表1 MI、CMI、BIT的質譜采集參數Table 1 MS/MS acquisition parameters of MI，CMI and BIT

*quantitative ion pair

質譜條件：離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正離子模式；檢測方式：多反應監測(MRM)；離子源溫度：550 ℃；霧化氣：0.38 MPa；輔助氣：0.38 MPa；氣簾氣：0.24 MPa；噴霧電壓：5 000 V，質譜采集參數見表1。

2 結果與討論

2.1 質譜-色譜條件的優化

2.1.1 質譜條件的優化MI、CMI、BIT 3種化合物的結構中均含氮基團，易結合質子得到正離子，因此選擇電噴霧電離正離子模式(ESI+)。分別配制50 μg/L的MI、CMI、BIT單標溶液，采用針泵進樣模式，進行一級母離子掃描，獲得準分子離子峰[M+H]+。選擇3種化合物的母離子(MI：m/z115.9、CMI：m/z149.9、BIT：m/z152.0),對每個母離子分別進行二級碎片掃描，得到碎片的離子信息，選取2個響應較大的碎片作為子離子，建立MRM離子對，分別優化DP、CE電壓值，3種化合物的質譜參數見表1。

圖1 MI、CMI和BIT的總離子流色譜圖Fig 1 Total ion chromatogram of MI，CMI and BIT

2.1.2 色譜條件的優化實驗采用Kinetex?C18柱(100 mm×3 mm，2.6 μm)進行分離，以甲醇-水為流動相，考察了甲醇-水的兩相比例及梯度洗脫程序，發現以甲醇-水(20∶80)、甲醇-水(30∶70)等度洗脫時，BIT的峰形差；當采取梯度洗脫程序時，3種異噻唑啉酮類物質在10 min內有較好的分離度和峰形。實驗同時考察了相同梯度洗脫條件下，甲醇-水和甲醇-2 mmol/L乙酸銨水溶液的分離效果，結果表明，甲醇-2 mmol/L乙酸銨梯度洗脫時，3種化合物的峰形較好，可有效降低基線背景，但響應強度低；而以甲醇-水梯度洗脫時，3種化合物的峰形好、響應強度高。因此，最終選用甲醇-水作為流動相，在梯度洗脫程序下，10 min內可完成分析，MI、CMI、BIT的保留時間分別為1.91、4.86、5.59 min。圖1為優化實驗條件下，5.0 μg/L異噻唑啉酮類化合物混合標準溶液的總離子流色譜圖。

2.2 樣品前處理條件的優化

2.2.1 提取溶劑的優化選擇超輕粘土、水晶泥陽性樣品進行提取溶劑的優化，由于異噻唑啉酮類化合物易溶于水、甲醇等有機溶劑，因此本實驗比較了水、甲醇、甲醇-水(1∶1，體積比)3種提取溶劑的提取效果。結果顯示，甲醇的提取效率明顯優于其他兩種溶劑，因此選擇甲醇作為最佳提取溶劑。

2.2.2 超聲提取時間的選擇以甲醇為提取溶劑，比較了不同超聲提取時間(5、10、20、30、40 min)對3種化合物提取效率的影響。結果顯示，隨超聲時間的延長，3種化合物的提取效率增大，超聲30 min后，繼續延長超聲時間，3種化合物的提取效率基本不變，故選擇最佳超聲時間為30 min。

2.3 方法學評價

2.3.1 基質效應基質效應是指樣品中除目標物以外的組分對目標物測定值的影響，一般有基質增強效應和基質減弱效應。在色譜-質譜聯用分析中，需對基質效應進行評價，并采取措施，保證結果的準確可靠。降低基質效應的常見方法有稀釋樣品溶液、增加凈化步驟、優化色譜分離條件、采用同位素內標、配制基質匹配標準溶液等[22]。本實驗考察了3種化合物在兩類造型玩具(水晶泥、超輕粘土)中的基質效應。采用標準曲線斜率比較法，即使用相對響應值法研究不同樣品對3種異噻唑啉酮類防腐劑的基質效應，根據公式Me=Am/Ac×100%進行量化評估，式中Me表示基質效應，Am表示基質匹配標準曲線斜率，Ac表示純溶劑標準曲線斜率。當Me<100%時，為基質抑制效應；當Me大于100%時，為基質增強效應。當90%≤Me≤110%為弱基質效應，無需采取補償措施。結果顯示，對于水晶泥樣品，MI的基質效應最明顯；對于超輕粘土樣品，MI、CMI的基質效應明顯(見表2)。為了消除基質效應的影響，本研究采用基質匹配標準曲線進行定量分析。

針對異噻唑啉酮類防腐劑含量較高的樣品，提取液上機濃度已超出標準曲線的線性范圍，需對提取液進行必要的稀釋處理。經實驗研究發現，當提取液稀釋10倍后進樣時，基質效應影響較小，可不考慮基質效應的影響。

表2 基質匹配標準曲線與溶劑標準曲線的比較Table 2 Comparison of matrix-matched calibration and solvent calibration

*:no data

2.3.2 線性范圍與檢出限在優化條件下，按“1.2”配制MI、CMI、BIT的系列濃度基質混合標準溶液，經LC-MS/MS測定后，以定量離子峰面積(Y)為縱坐標，分析物質量濃度(X，μg/L)為橫坐標，繪制標準曲線。MI、CMI、BIT在甲醇-水、水晶泥基質、超輕粘土基質中的線性方程、相關系數(r)、檢出限(LOD,S/N=3)及定量下限(LOQ,S/N=10)列于表2。結果顯示，MI、CMI、BIT均在1.0～100.0 μg/L范圍內呈良好的線性關系，相關系數均不小于0.999 0，MI、CMI和BIT的儀器定量下限分別為0.5、0.5、1.0 μg//L，方法檢出限分別為10、10、20 μg/kg，方法定量下限分別為30、30、60 μg/kg。

2.3.3 回收率與相對標準偏差在水晶泥、超輕粘土陰性樣品中分別添加0.06、0.6、2.0 mg/kg混合標準溶液，指畫顏料陽性樣品中分別添加4、8、10 mg/kg混合標準溶液，每個濃度水平加標5次，按優化方法進行加標回收率實驗?？紤]基質效應，其中水晶泥、超輕粘土陰性樣品用基質匹配標準曲線校正，指畫顏料陽性樣品用甲醇-水配制的標準曲線校正，并計算回收率和相對標準偏差(RSD)，結果見表3。結果表明：MI、CMI、BIT的平均回收率為80.2%～109%，RSD不大于8%，方法的準確度及精密度均滿足日常檢測的需求。

表3 不同基質中 MI、CMI和BIT的回收率及相對標準偏差Table 3 Recoveries and RSDs of MI,CMI,BIT in different matrixes

*no detected

2.3.4 實際樣品的檢測取市售15種兒童彩泥類造型玩具，采用本方法測定樣品中MI、CMI和BIT含量。結果顯示，7批次產品中檢出異噻唑啉酮類防腐劑(如表5)，檢出樣品包括水晶泥類、超輕粘土類和指畫顏料類，其中有3批次超出了歐盟玩具指令中規定的限量要求。

表5 7種兒童彩泥類造型玩具中3種異噻唑啉酮類防腐劑的含量Table 5 Contents of three isothiazolinone preservatives in 7 samples of modeling toys

*no detected

3 結 論

本文建立了HPLC-MS/MS快速測定兒童彩泥類造型玩具中3種異噻唑啉酮類防腐劑的分析方法。該方法簡單、靈敏，具有較高的準確性和重現性，方法的檢出限和定量下限可滿足歐盟玩具協調標準EN 71-9:2005+A1:2007中對3種防腐劑的限量要求。應用本方法對15批彩泥類造型玩具樣品進行了檢測，檢出7批次陽性樣品，其中3批次超出限量要求，說明該類玩具在生產過程中存在超量使用3種異噻唑啉酮類防腐劑的情況，存在安全風險，政府應加強監管。