陶斯湄，朱冬林,陳艷華，吳惠勤,周 熙,徐長志，謝芝芝，陶 玲，席 云*

(1.中山大學附屬第三醫(yī)院 藥劑科，廣東 廣州 510630；2.中山大學附屬第三醫(yī)院 檢驗科，廣東 廣州510630；3.廣州博康生物技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510440；4.廣東省測試分析研究所 廣東省化學危害應急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東省分析測試技術(shù)公共實驗室，廣東 廣州 510070)

塑化劑，亦稱增塑劑，是一種用于增加物品柔軟性和伸展性的高分子材料助劑，被廣泛應用于食品包裝、玩具、家具、洗化用品中。目前常見的塑化劑有200多種，其中鄰苯二甲酸酯類(PAEs)占比最多，約占總產(chǎn)量的80%[1-2]。研究表明，PAEs具有致癌、致畸、致突變等效應[3-4]，攝入過量可損害肺、腎臟、睪丸等器官[5-7]。PAEs的分子結(jié)構(gòu)具有芳香族基團，有一定的類雌激素活性，因此被稱為環(huán)境類雌激素。其在人體內(nèi)過量累積會使男性的雄激素水平下降，使女童發(fā)育性早熟。2007年，歐盟開始在玩具和兒童用品的生產(chǎn)中禁止使用鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)，以及限制使用鄰苯二甲酸二異壬酯(DiNP)、鄰苯二甲酸二異癸酯(DiDP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DnOP)[8]。2011年6月起，我國也將PAEs列入非法和濫用的食品添加劑名單[9]。

由于PAEs在塑料中與高聚物基質(zhì)間以非共價鍵的形式連接，相互作用力較弱，導致PAEs在塑料制品的生產(chǎn)、使用與儲存過程中極易釋放到環(huán)境中[10]。研究證實，PAEs廣泛存在于大氣、土壤、水等環(huán)境介質(zhì)[11-13]，在食物中也有檢出[14-15]。人體可通過皮膚、消化道和肺部等途徑吸收食品與環(huán)境中的PAEs[16-17]。通過生物監(jiān)測技術(shù)研究人體生物樣品(血液、唾液、尿液等)中PAEs的濃度水平和指紋特征，能夠反映該人群對污染物暴露的情況，而血液是研究PAEs暴露水平的重要介質(zhì)[18-19]。

珠三角地區(qū)人口密集，經(jīng)濟發(fā)展快速，塑料制品用量大，因此人群PAEs暴露具有潛在的健康風險，但相關(guān)研究較少。本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法對隨機采集的珠三角地區(qū)人群血漿中的16種PAEs進行分析，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)人群血漿中PAEs的暴露水平相比其它地區(qū)較低，但DEHP具有較高水平，需引起重點關(guān)注。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1290-6590高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(美國Agilent公司)。16種PAEs混標(1 000 μg/mL)：鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(DiBP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(DnBP)、鄰苯二甲酸二(2-甲氧基乙基)酯(DMEP)、鄰苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(BMPP)、鄰苯二甲酸二(2-乙氧基乙基)酯(DEEP)、鄰苯二甲酸二戊酯(DPP)、鄰苯二甲酸二己酯(DHXP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)、鄰苯二甲酸二環(huán)己基酯(DCHP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二苯酯(DPhP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DnOP)、鄰苯二甲酸二壬酯(DNP)、鄰苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(DBE)，以及對應的16種D4-PAEs混標(10 μg/mL)均購于天津阿爾塔科技有限公司。正己烷、乙腈(色譜純，美國Thermo Fisher公司)；甲酸(色譜純，美國Sigma-Aldrich公司)。

1.2 樣品采集與前處理

隨機采集100例珠三角地區(qū)人群的血漿樣品(53例女性、47例男性，年齡在1～92歲)。樣品進行抗凝處理后，以3 000 r/min離心10 min，將上層血漿轉(zhuǎn)移至玻璃離心管，于4 ℃保存待測。

在1.0 g血漿樣品中加入2 ng PAEs內(nèi)標，渦旋混勻，用0.5 mL乙腈沉淀蛋白后，加入1 mL正己烷，渦旋1 min，3 000 r/min離心5 min后，取上層清液。重復萃取3次，合并上清液，濃縮至干，用0.2 mL乙腈復溶，以2 000 r/min離心5 min后，上清液進行HPLC-MS/MS分析。

1.3 HPLC-MS/MS測定條件

色譜條件：捕集柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus RRHD(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)；色譜柱：Agilent Extend C18RRHD(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；柱溫：40 ℃；流動相：A為0.2%甲酸水溶液，B為乙腈；流速：0.45 mL/min；洗脫梯度：0～1.0 min，35%B；1.0～7.5 min，35%～57%B；7.5～10.0 min，57%～80%B；10.0～11.0 min，80%～90%B;11.0～14.5 min，90%～95%B；14.5～15.0 min，95%～100%B;15.0～16.0 min，100%B；16.0～18.0 min，100%～35%B；進樣量：2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧(ESI)正離子模式掃描，多反應監(jiān)測(MRM)模式采集；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：8 L/min；霧化氣壓力：3.1 MPa；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流量：11 L/min；毛細管電壓：4 000 V。16種PAEs的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 16種PAEs的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric acquisition parameters of 16 PAEs

*quantitative ion

1.4 質(zhì)量控制

在每個樣品分析前加入同位素內(nèi)標，采用內(nèi)標法定量，以3倍標準偏差為檢出限。每20個樣品添加1個方法空白樣品。為降低實驗空白，實驗過程避免使用塑料制品。所有玻璃儀器均采用丙酮超聲清洗后，以正己烷淋洗。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析。未檢出PAEs的樣品，則以1/2方法檢出限(MDL)對應的濃度進行分析。不同性別與年齡人群的血漿中PAEs濃度采用t檢驗與單因素方差分析進行差異性比較。結(jié)果均以P<0.05作為差異顯著性檢驗水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC-MS/MS測定血漿中PAEs

目前，HPLC-MS/MS法是檢測血漿中PAEs的常用方法。但由于血漿樣品基質(zhì)復雜，需結(jié)合高效的樣品前處理方法以降低基質(zhì)效應。然而，由于PAEs廣泛存在于環(huán)境中，因此復雜的前處理過程(如固相萃取)易造成較大空白，對血漿中低濃度PAEs的測定結(jié)果影響較大。本實驗采用簡單的蛋白沉淀和液液萃取前處理方法，通過加入同位素內(nèi)標校正基質(zhì)的干擾，同時降低了實驗空白，提高了定量準確度。

在“1.3”優(yōu)化條件下，16種PAEs標準樣品的MRM色譜圖見圖1。16種PAEs的分離度良好，且3對同分異構(gòu)體實現(xiàn)了基線分離，方法檢出限為0.001～2.00 ng/g。空白樣品中檢出DMP、DiBP、DnBP與DEHP，檢出量分別為(0.07±0.02) ng/g、(0.07±0.02) ng/g、(0.49±0.03) ng/g與(1.00±0.43) ng/g。實驗結(jié)果經(jīng)空白扣除。

2.2 人群血漿中PAEs的暴露水平

采用本方法對“1.2”的100例血漿中16種PAEs的殘留量進行測定，結(jié)果如表2所示。其中檢出DMP、DiBP、DnBP、DEHP、DCHP與BBP。100例樣品中均有PAEs檢出，上述6種PAEs的檢出總量(∑PAEs)為12.4～1 399 ng/g，中值與平均值分別為39.8 ng/g與57.7 ng/g。其中DEHP的含量最高，檢出率為100%，檢出量為11.1～1 398 ng/g，中值與平均值分別為38.7 ng/g與57.0 ng/g。DiBP與DnBP兩種同分異構(gòu)體的檢出量為

圖1 標準樣品中PAEs的 MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of PAEs in standard sample

DMP、DiBP、DnBP與DEHP是血液中常見的4種PAEs。王帥等[20]在哈爾濱市孕婦血液中檢出上述4種PAEs，其質(zhì)量濃度分別為84～622 ng/mL、87～876 ng/mL、116～833 ng/mL與87～1 264 ng/mL。除DEHP外，其它3種PAEs的暴露水平顯著高于本實驗。同時，本實驗DMP、DiBP、DnBP與DEHP的暴露水平也低于黃曉群等[21]的報道值。近年來，隨著對PAEs毒性研究的深入，以及對含PAEs制品監(jiān)控力度的加大，環(huán)境中PAEs的水平逐漸降低。研究顯示，我國室內(nèi)灰塵中DEHP的含量從2012年的1 190 μg/g下降至2018年的25.6 μg/g[22]。同時，我國衛(wèi)生部也將DEHP等17種PAEs列為違法添加的非食用物質(zhì)，禁止在食品中使用。而食品是人體PAEs暴露的重要來源之一[23]。隨著環(huán)境介質(zhì)與食品中PAEs濃度的降低，人體內(nèi)PAEs的暴露水平也逐漸下降。因此，與早期的研究結(jié)果相比，本實驗在珠三角地區(qū)人群血漿中檢測的PAEs暴露水平較低。

由于DEHP的使用量較大，且在環(huán)境中的降解速率低于短鏈PAEs，導致其在人體中具有較高的暴露水平。研究表明，DEHP對肝臟、腎臟及甲狀腺等均有明顯的毒性效應[24-25]。同時，還具有生殖毒性，可引起男性不育癥[26]。人體血漿中DEHP的高暴露水平預示了其潛在的健康風險，需引起重點關(guān)注。

表2 人群血漿中PAEs的暴露水平Table 2 PAEs exposure level in human plasma

*not detected

圖2 血漿中PAEs的組成特征Fig.2 Component characteristics of PAEs in plasma

2.3 血漿樣品中PAEs的組成特征

血漿中PAEs的組成特征見圖2。結(jié)果顯示，DMP、DiBP、DnBP、DEHP、DCHP與BBP的占比分別為0～1.44%、0～0.59%、0～15.65%、90.01%～99.96%、0～0.24%和0～1.53%，其平均值分別為0.29%、0.33%、1.25%、98.09%、0.003%和0.02%。所有樣品中DEHP的占比均大于90%。DEHP是生產(chǎn)和消費量最大的PAEs，占PAEs總量的70%以上[26]。同時，由于長鏈PAEs的代謝速率較短鏈PAEs慢[27]，使得其易在血液中累積。

圖3 不同性別(A)與不同年齡(B)人群血漿中的PAEs含量Fig.3 Contents of PAEs in human plasma with different sexs(A) and different ages(B)

2.4 性別與年齡對PAEs暴露的影響

不同性別與年齡人群血漿樣品中PAEs的暴露水平見圖3。采用t檢驗法與單因素方差分析分別研究不同性別與年齡組間PAEs暴露水平的差異。圖3A結(jié)果顯示，檢出率較高的4種PAEs(DMP、DiBP、DnBP與DEHP)在女性血漿中的平均暴露水平高于男性，但僅DMP在兩組樣品中存在顯著性差異(P<0.05)。研究表明，PAEs在人體內(nèi)的暴露水平與人群生活習慣有關(guān)。相對于男性，女性處于室內(nèi)環(huán)境的時間可能較長，而室內(nèi)空氣與灰塵是人體PAEs暴露的另一重要來源[28]。另外，個人護理品也是人體PAEs暴露的重要來源，而女性個人護理品的使用量相對于男性較高。

比較上述4種PAEs在不同年齡段人群的暴露水平發(fā)現(xiàn)(圖3B)，DMP在21～40歲年齡段人群的暴露水平顯著高于41～60歲人群，DiBP在0～20歲人群的暴露水平顯著高于>60歲年齡段人群(P<0.05)。其它年齡段人群的暴露水平則無顯著差異。有文獻對比了同一地區(qū)兒童、青年與成人體內(nèi)的PAEs代謝物濃度，發(fā)現(xiàn)兒童與青年的PAEs暴露水平高于成人[29]，這與本實驗結(jié)果類似。不同年齡人群的PAEs暴露水平影響因素較多。室內(nèi)灰塵與飲食是人群PAEs暴露的主要途徑[23]。研究表明，兒童通過室內(nèi)灰塵暴露的PAEs水平顯著高于成人[22]。而我國不同年齡人群通過飲食暴露PAEs的水平差異研究較少，需在后續(xù)實驗中進行研究。

3 結(jié) 論

本文采用HPLC-MS/MS法研究了珠三角地區(qū)人群血漿中PAEs的暴露情況。結(jié)果表明，DMP、DiBP、DnBP、DEHP、DCHP與BBP等6種PAEs檢出。其中DEHP的檢出率為100%。DMP、DiBP與DnBP的檢出率分別為49.0%、98.0%、62.0%。僅5.00%的樣品中檢出DCHP與BBP。∑PAEs為12.4～1 399 ng/g，其中DEHP所占比例最高，為90.01%～99.96%。女性與低年齡組(≤40歲)人群的血漿中PAEs濃度較高，但僅DMP存在顯著性差異。除DEHP外，珠三角地區(qū)人群的PAEs暴露水平較低。但DEHP暴露水平較高，顯示具有潛在的健康風險，需引起重點關(guān)注。