基于聚多巴胺納米粒子的熒光增強型探針檢測乙酰膽堿酶

杜方凱，李夢汝，莫遠健，譚學才，黃乃陽，黃安娜

(廣西民族大學 化學化工學院，廣西高校食品安全與藥物分析化學重點實驗室，廣西林產化學與工程重點實驗室，廣西 南寧 530006)

乙酰膽堿酶(Acetylcholinesterase,AChE)是存在于生物體中樞神經系統中的一種絲氨酸蛋白酶，能催化神經遞質乙酰膽堿的水解，具有終止神經傳導的作用[1-2]，且與阿爾茨海默病密切相關[3-4]。因此，建立一種準確、靈敏、簡便、特異性檢測AChE的方法在阿爾茨海默病的診斷和治療方面具有重要意義。

近年來，用于AChE檢測的方法主要有比色法[5-7]、化學發光法[8]、電化學法[9-11]和熒光法[12-14]。其中，熒光法因具有靈敏度高、響應時間快、實時檢測酶活性的優點，引起廣泛關注[15-24]。迄今為止，研究者基于有機染料[25]、量子點[26]、重金屬納米簇[27-28]等熒光材料已構建了一些檢測AChE的熒光探針。但上述熒光材料均存在有機染料水溶性和光穩定性差、量子點的毒性、貴金屬納米簇穩定性低和成本高等缺點。因此，發展價格低、水溶性和光穩定性好可用于AChE熒光檢測的材料仍然存在挑戰。

圖1 基于F-PDA對乙酰膽堿酶的檢測示意圖Fig.1 Schematic illustration of the F-PDA for AChE detection

聚多巴胺熒光納米粒子(F-PDA)是在氧化應激或堿性(pH>7.5)條件下，多巴胺通過共價鍵、氫鍵、π-π等相互作用聚合而成的一種新型納米材料[29]。F-PDA不僅具有顯著的光學、電學和磁學特性，還具有良好的生物相容性和生物降解性，廣泛應用于能源、水處理、分析檢測等各個材料科學領域[30-31]。目前，基于聚多巴胺熒光納米粒子的熒光響應分析已應用于堿性磷酸酶定量測定[32]。

本研究以多巴胺鹽酸鹽為原料，采用一步法合成了F-PDA,與MnO2納米片復合時，其熒光猝滅；而當體系中存在AChE時加入硫代乙酰膽堿(ATCh)，AChE可以催化ATCh水解生成硫代膽堿(Thiocholine,TCh)，而將MnO2還原為Mn2+并引發MnO2納米片的分解，導致F-PDA的熒光恢復，基于此，實現了對AChE的熒光檢測(響應機理見圖1)，方法操作簡單、靈敏度高、成本低。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

多巴胺鹽酸鹽、氫氧化鈉(NaOH)、37%鹽酸(HCl)、磷酸二氫鈉·二水(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氫二鈉·十二水(Na2HPO4·12H2O)、四水合氯化錳(MnCl2·4H2O)、四甲基氫氧化銨(TMA·OH)、雙氧水(H2O2)、乙酰硫代膽堿碘化物(ATCh)購自阿拉丁化學試劑有限公司；乙酰膽堿酯酶、牛血清蛋白、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、青霉素酶、溶菌酶均購自康為世紀生物科技有限公司，其他試劑為市售分析純，實驗用水為超純水。

F4600型熒光分光光度計、H-7650型透射電鏡(日本日立公司)，紫外可見分光光度計(美國瓦里安公司)。

1.2 實驗過程

1.2.1 F-PDA納米粒子的合成根據文獻方法[33]修改后合成F-PDA粒子：首先用超純水配制濃度為20 mmol/L多巴胺鹽酸鹽溶液，再精密量取400 μL多巴胺鹽酸鹽溶液與320 μL 100 mmol/L氫氧化鈉溶液加入7.08 mL 2 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)中，隨后在磁力攪拌器上于室溫下攪拌1 h，最后加入200 μL 0.2 mol/L鹽酸調節反應體系至酸性，降低反應的聚合速率，終止反應，得亮褐色聚多巴胺熒光納米粒子(F-PDA)溶液。

1.2.2 MnO2納米片的制備根據文獻方法[34]制備MnO2納米片：稱取2.174 8 g四甲基氫氧化銨(TMA·OH)溶于18 mL超純水中，再加入2 mL 30%(質量分數)H2O2中得到0.6 mol/L含3%(質量分數)H2O2的TMA·OH溶液。將10 mL 0.3 mol/L MnCl2溶液加入100 mL三口圓底燒瓶中，再將20 mL TMA·OH溶液(0.6 mol/L，含3% H2O2)迅速倒入三口圓底燒瓶中(該步驟需在15 s內完成)，可觀察到2種無色溶液混合后迅速變成深棕色懸浮液，于室溫下攪拌24 h，待反應結束后，以10 000 r/min離心10 min，再用乙醇洗滌7次(每次15 mL)，冷凍干燥后得固體MnO2納米片。

1.2.3 AChE活性檢測取750 μL二氧化錳納米片溶液(512 μg/mL)和200 μL F-PDA納米粒子添加至1 830 μL的PBS(pH 7.4，10 mmol/L)溶液中，并于37 ℃下孵育2 min。然后分別將120 μL ATCh溶液(50 mmol/L)和100 μL不同濃度(終濃度為0、5、10、25、100、250、500 mU/mL)的AChE與上述F-PDA-MnO2納米復合溶液混合，在37 ℃下反應40 min，最后進行熒光測量。

2 結果與討論

2.1 F-PDA與MnO2納米片的表征

本氧化法制備的F-PDA分散性較好，由電子透射電鏡圖可見其平均粒徑約18 nm(圖2A)。F-PDA的紫外-可見吸收光譜圖在約287 nm處有一個特征吸收峰(圖2B)，其熒光激發和發射光譜在415 nm處有一個強熒光激發峰，在458 nm處發出強的熒光發射峰(圖2C)，其熒光強度在激發波長為360～440 nm范圍內呈先增大后降低的趨勢(圖2D)，最大發射波長依然為458 nm，表明F-PDA熒光納米粒子不具有激發波長依賴性。由此可見，F-PDA熒光納米粒子已成功制備。

MnO2納米片是以MnCl2為原料，在TMA和H2O2下發生氧化反應獲得，對其進行紫外-可見光譜表征，發現吸收光譜在300～600 nm范圍出現寬的吸收峰，且在約400 nm處出現峰值，與F-PDA的發射峰有很好的重疊，是F-PDA理想的能量受體，為構建FRET體系提供了基礎。為進一步確認MnO2納米片的性質，對其進行了拉曼光譜測試(圖3B)，發現在565.3、653.8 cm-1處有2個明顯的峰，歸因于Mn—O的拉伸振動，表明MnO2納米片已成功制備。

設計了以F-PDA為熒光信號團、MnO2納米片為猝滅劑的生物復合探針用于AChE檢測(圖4)。結果顯示，在415 nm激發波長下，F-PDA在458 nm處有一強發射峰(曲線a)，當加入MnO2納米片后，其熒光強度顯著降低(曲線b)，這是由于F-PDA和MnO2納米片之間發生了FRET效應。而在ATCh和AChE的作用下，猝滅的熒光被恢復(曲線c)，這是因為AChE能夠催化ATCh水解產生了能誘導MnO2納米片分解的硫代膽堿(TCh)，使體系熒光恢復[14]。由此可見，F-PDA@MnO2和F-PDA@MnO2-ATCh-AChE能使F-PDA熒光產生顯著的猝滅和恢復，表明構建的F-PDA@MnO2熒光探針可用于AChE檢測。

圖4 F-PDA(a)、F-PDA@MnO2(b)和F-PDA@MnO2-ATCh-AChE(c)的熒光發射光譜圖Fig.4 Fluorescence emission spectra of the F-PDA(a),F-PDA@MnO2(b) and F-PDA@MnO2-ATCh-AChE(c)

2.2 實驗條件的優化

2.2.1 pH值對F-PDA熒光的影響實驗考察了不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)對F-PDA熒光強度的影響，結果顯示，F-PDA的熒光強度隨pH值增大而增強，且在pH=7.0時達最大值，并在堿性條件下趨于穩定。綜合考慮熒光強度和生理環境，選擇pH 7.4為后續測試條件。

2.2.2 MnO2濃度對F-PDA熒光猝滅的影響探針中MnO2納米片的濃度對F-PDA納米顆粒的熒光強度有顯著影響。在熒光共振能量轉移(FRET)的基礎上，F-PDA納米顆粒在458 nm處的熒光強度隨MnO2納米片濃度的增加逐漸降低(圖5A)，猝滅效率隨之增加(圖5B)。當MnO2納米片質量濃度增至128 μg/mL時，猝滅效率上升緩慢，基本達到平衡。當MnO2納米片質量濃度增至192 μg/mL，猝火效率可達84%。由于較低濃度的MnO2納米片無法較高程度地猝滅F-PDA的熒光，而高濃度MnO2納米片雖可完全猝滅F-PDA的熒光，但游離的MnO2納米片優先與TCh反應導致敏感度偏低。因此，選擇128 μg/mL MnO2納米片為實驗最佳濃度。

圖6 不同體系下的紫外光譜圖Fig.6 UV-Vis absorption spectra of different systems

圖7 不同濃度乙酰膽堿酶對F-PDA@MnO2體系的熒光恢復光譜Fig.7 Fluorescence recovery spectra of different concentrations of AChE for F-PDA@MnO2 systemCAChE:0,5,10,25,50,100,250,500 mU/mL

2.2.3 底物ATCh濃度對F-PDA@MnO2熒光探針的影響

AChE可催化ATCh水解生成具有還原性的TCh，兩者具有相關性，且化學計量比為1∶1。因此，實驗根據文獻方法合成了TCh[35]，研究底物ATCh濃度對探針的影響。結果顯示，在添加1 mmol/L TCh后，可明顯觀察到F-PDA熒光的恢復，繼續增大TCh濃度至2 mmol/L，F-PDA的熒光恢復達到最大值。因此，實驗選擇底物ATCh濃度為2 mmol/L。為了驗證F-PDA熒光恢復機理，對不同體系的紫外-可見吸收光譜進行了掃描(圖6)。由圖可見，F-PDA和MnO2納米片分別在287 nm(曲線a)和400 nm(曲線b)處有一特征吸收峰。當F-PDA與MnO2復合后，體系兼具兩者的特征吸收峰(曲線c)。加入TCh后，MnO2的特征吸收峰消失(曲線d)，Mn2+的吸收光譜未顯示出任何吸收峰(曲線e)，F-PDA@MnO2-TCh體系的吸收光譜非常接近F-PDA或F-PDA-Mn2+的吸收光譜(曲線f)，由此證明TCh能將MnO2納米片還原為Mn2+。

2.3 復合物探針對AChE的檢測

在最優實驗條件下，采用F-PDA@MnO2復合物探針對AChE進行檢測(圖7)。結果顯示，隨著AChE濃度的增加，體系熒光強度逐漸增強，5.0 mU/mL AChE即可觀察到明顯的熒光恢復，100 mU/mL AChE可使F-PDA的熒光恢復90%以上，且在5.0～100 mU/mL范圍內，體系熒光強度與AChE濃度呈良好的線性關系，線性方程為IF=5.554CAChE+326.769(r2=0.996)，由此計算得檢出限(LOD,S/N=3)為0.14 mU/mL，表明探針可靈敏檢測AChE。

在優化條件下，向PBS緩沖溶液中加入不同濃度(30、60、90 mU/mL)的AChE標準溶液進行回收率研究。結果顯示，其加標回收率為89.5%～120%，相對標準偏差(RSD，n=3)為1.6%～2.5%(表1)。表明該方法可應用于緩沖溶液中AChE的檢測。

2.4 探針的選擇性

在F-PDA@MnO2檢測體系中分別加入20 μg/mL過氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(GOx)、青霉素酶(PCN)、溶菌酶(Lys)、牛血清蛋白(BSA)考察探針的選擇性。結果顯示所加物質對體系熒光強度幾乎無影響，不干擾AChE的測定，說明該體系對AChE具有較好的選擇性。

表1 乙酰膽堿酶的回收率Table 1 Recoveries of acetylcholinesterase

3 結 論

本研究以多巴胺為原料，通過氧化法合成了具有強烈熒光的水溶性聚多巴胺納米粒子，基于MnO2納米片復合的 F-PDA@MnO2構筑了增強型熒光探針用于AChE的高靈敏檢測。結果顯示，所制備的F-PDA@MnO2熒光探針具有靈敏度高、選擇性好及檢出限低等優點，可為拓展F-PDA納米粒子在其他生物分子檢測方面的應用提供數據參考。