青蒿素工業提取廢料丙酮層中貓眼草黃素等3種多甲氧基黃酮富集研究

李 鑫，王可軒，李東輝，陳 靖

1哈爾濱商業大學藥學院，哈爾濱 150076；2揚州大學醫學院 轉化醫學研究院；3江蘇省中西醫結合老年病防治重點實驗室，揚州 225001

多甲氧基黃酮(polymethoxylated flavones，PMFs)是一類含有多個甲氧基、低極性、具平面結構和強烈生物活性的黃酮類成分[1,2]，主要存在于黃花蒿[3]、澤漆(俗稱貓眼草)、巖筋菜、細花線紋香茶菜[4]。實驗研究表明PMFs具有抗癌、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗誘變等藥理作用[5,6]。貓眼草黃素(chrysosplenetin，CHR)、蒿黃素(artemetin)、槲皮萬壽菊素(quercetagetin-3,7,3′,4′-tetramethyl ether)是較常見的多甲氧基黃酮，化學結構見圖1。文獻報道黃花蒿葉片中的多甲氧基黃酮對青蒿素的抗瘧活性具有明顯增強作用[7]；貓眼草黃素對手足口病主要病原體腸道病毒71(EV71)具有較強的抑制活性，能夠有效抑制病毒RNA的合成[8]；文獻還報道其有較強的細胞毒性，能誘導細胞凋亡而具有抗癌活性[6]。本課題前期也發現CHR可能通過抑制青蒿素代謝相關肝代謝酶CYP3A和ABC轉運體P-糖蛋白的活性，顯著提高青蒿素生物利用度，提高青蒿素抗瘧活性，顯示出作為青蒿素耐藥逆轉劑的潛力[9-11]，同時CHR不僅具有較強的抗腫瘤活性[6]，且可能提高化療藥的敏感性。通過對黃花蒿不同生長期青蒿素及4種多甲氧基黃酮CHR、casticin、eupatin和artemetin含量分析[12]，發現黃酮和青蒿素一樣在盛蕾期含量最高，因此采集期一致，這為從青蒿素生產廢料中獲得CHR等多甲氧基黃酮奠定了重要理論基礎，而通常在青蒿素原料藥的工業化生產過程中，這些黃酮類成分都在復雜的除雜凈化過程中，被當成雜質浪費掉了，并沒有得到充分的利用。

圖1 化合物1～3的化學結構Fig.1 The chemical structures of compounds 1-3 注：1-貓眼草黃素;2-蒿黃素;3-槲皮萬壽菊素。Note:1-CHR;2-artemetin;3-quercetagetin-3,7,3′,4′-tetramethyl ether.

化合物分子大小、極性大小、酸性強弱是黃酮類化合物分離純化的重要依據。常用的分離方法包括pH梯度萃取法、HPLC色譜法、柱色譜法。其中柱色譜法又分為硅膠柱色譜、聚酰胺柱色譜、葡聚糖凝膠柱色譜、大孔樹脂色譜法。多甲氧基黃酮的分離以柱色譜法運用最為廣泛[13]。Yu等[14]運用高速逆流色譜法分離純化青皮中六種PMFs；Liu等[15]采用大孔樹脂分離純化了陳皮中PMFs類化合物。本文結合大孔樹脂、硅膠、凝膠柱色譜法，以含目標化合物的青蒿素工業生產廢料丙酮層為原料，建立了3種活性多甲氧基黃酮化合物的精制純化方法，既為后續的機制研究提供原料，也為青蒿素生產廢料的循環再利用做出了有益的探索。

1 材料與儀器

1.1 樣品

重慶華立控股股份有限公司提供青蒿素各段工業廢料共五部分，包括石油醚層、石油醚-乙酸乙酯層、丙酮層、乙醇層、提取后殘渣。各層性狀：石油醚層、石油醚-乙酸乙酯層為油狀，丙酮層、乙醇層為膏狀，丙酮層為黃綠色，乙醇層顏色略深。

以自制CHR(1)、artemetin(2)、quercetagetin-3,7,3′,4′-tetramethyl ether(3)(沈陽藥科大學天然藥物化學系提供，純度大于98%，編號分別為200901、200902、200903)為對照品，RP-HPLC-DAD監測發現只有丙酮層檢測到目標化合物。

1.2 材料與試劑

HPD-100大孔樹脂、薄層層析硅膠GF254、柱層析硅膠(200～300目)、Sephadex LH-20均購自青島海洋化工廠分廠；色譜甲醇、乙腈購自美國Fisher公司；二氯甲烷、甲醇、丙酮、石油醚均為分析純；乙醇為工業級。

1.3 儀器

日立L-2000高效液相色譜儀(日立高新技術有限公司)；R206型旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司)；R206型旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司)；循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；ZK-82B型真空干燥箱(上海市實驗儀器總廠)；DHG-9075A型電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；AL-104電子天平(美國METTLER TOLEDO)；KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 溶液的配制

標準溶液的配制：分別精密稱取CHR、artemetin、quercetagetin-3,7,3′,4′-tetramethyl ether對照品各10 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解，搖勻，稀釋至刻度，分別配制成1.0 mg/mL的儲備液，置4℃冰箱內儲存備用。

2.2 色譜條件

色譜柱：Waters C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動相A:乙腈-B:水(V/V)，采用梯度洗脫：0～30 min，30%A；30～35 min，30%～60%A；35～38 min，60%～100%A，38～45 min，100%～30%A；流動相用0.45 μm微孔濾膜過濾，超聲20 min脫氣；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μL。

2.3 黃酮的分離純化工藝

2.3.1 除色素方法選擇

丙酮層各取1 g，分別用3 g SiO2gel、3 g MgO、3 g polyamide、5 g HPD-100(60～100目)處理，選擇除色素方法，結果表明HPD-100處理速度快，樣品損失少為最佳除色素法。

2.3.2 精制條件初篩

取浸膏約2 g，經HPD-100(60～100目)大孔樹脂處理，分別以60%、70%、80%、90%乙醇，100%甲醇和氯仿洗脫，90%乙醇和100%甲醇洗脫物有大量絮狀沉淀析出，分別過濾，甲醇洗滌沉淀后，用氯仿溶解。各餾分采用RP-HPLC-UV分析，追蹤目標化合物。

取約500 mg HPD-80%洗脫物，3 g硅膠拌樣，10 g空白硅膠上樣，石油醚-丙酮-乙酸乙酯梯度洗脫，HPLC跟蹤結果表明16∶1∶1至12∶1∶1部分有目標化合物。

2.3.3 精制條件確定

2.3.3.1 HPD大孔樹脂分離

按照前期摸索工藝，取丙酮層浸膏150 g，氯仿溶解，150 g HPD-100(60～100目)拌樣，揮干，上HPD-100大孔樹脂，樹脂用量濕重2 kg，分別用60%、70%、80%、90%EtOH/H2O依次進行洗脫(EtOH/H2O濃度為V/V)，減壓回收溶劑。各餾分以HPLC-UV進行追蹤分析。

取丙酮層浸膏約150.0 g，加入適量二氯甲烷，超聲至完全溶解，備用。150 g HPD-100(60～100目)拌樣，揮干。取HPD-100(60～100目)大孔樹脂置燒杯中，樹脂用量濕重2 kg，加入乙醇，浸泡0.5 h。將浸泡后的大孔樹脂移至層析柱中，反復用乙醇沖洗。

2.3.3.2 上樣洗脫

待層析柱中大孔樹脂沉降好后，沿柱壁慢慢加入樣品，分別用60%、70%、80%、90% EtOH/H2O梯度洗脫。收集層析柱各餾分，每瓶接樣500 mL，減壓回收洗脫溶劑。通過TLC追蹤進行樣品合并，以HPLC進行定性鑒別。

2.3.3.3 硅膠柱層析

含有目標化合物的樣品：分別采用氯仿-甲醇、氯仿-丙酮、石油醚-丙酮溶劑系統進行分離，最終確定石油醚-丙酮系統。取含有目標化合物的洗脫部分，加入適量二氯甲烷，超聲至完全溶解，備用。稱取硅膠70 g，加入石油醚浸泡0.5 h，揮干溶劑，分次加入樣品液，攪拌混勻。充分研磨，揮干溶劑，得黃色粉末，備用。

稱取硅膠(200～300目)約700 g，105 ℃活化30 min。加入石油醚浸泡約0.5 h，不斷用玻璃棒攪拌，使硅膠充分溶漲，備用。將溶漲后的硅膠注入層析柱中，并不斷攪拌。石油醚沖洗硅膠柱，靜置過夜，備用。

待層析柱中硅膠沉降好后，緩慢加入樣品。洗脫體系為石油醚∶丙酮(100∶0～0∶100)。收集層析柱各餾分，保留體積約400 mL，減壓回收洗脫溶劑。洗脫液經薄層色譜檢測，合并組成相似的餾分，顯色試劑為10%硫酸-乙醇溶液。

2.3.3.4 凝膠柱層析

稱取Sephadex LH-20約100 g，置燒杯中，加入甲醇，并不斷用玻璃棒輕輕攪拌，靜置過夜。在攪拌下快速將泡好的Sephadex LH-20移置層析柱中，反復利用甲醇沖洗凝膠柱，靜置12 h，備用。

待層析柱中凝膠沉降好后，且層析柱中無氣泡，打開活塞放甲醇至液面為0.5～1 cm處。濕法上樣，將準備好的樣品用少量適宜溶劑溶解，用膠頭滴管將樣品轉移至層析柱內，加入甲醇進行洗脫，TLC追蹤并合并相同餾分。

經過反復硅膠柱層析、凝膠柱層析、薄層層析等多種分離手段進行分離，得到純度較高的化合物1～3，具體分離流程如下：丙酮層150 g，HPD-D101大孔樹脂梯度洗脫(100～200目)得到含目標化合物的70%EtOH/H2O洗脫物99 g，經硅膠柱層析(200～300目)，石油醚-丙酮梯度洗脫，其中100∶13部位黃色粗結晶A經Sephadex LH20純化得到化合物1(1 000 mg)，100∶15部位黃色粗結晶B經Sephadex LH20純化得到化合物2(3 000 mg)，100∶20部位黃色粗結晶C經Sephadex LH20純化得到化合物3(500 mg)。

2.3.8 樣品檢識

毛細管吸取少量樣品溶液，點在硅膠薄層層析板上，選用合適的展開系統進行展開，晾干，用10%的濃硫酸乙醇溶液顯色，在紫外燈下觀察熒光。若在薄層層析硅膠板上顯示為單一斑點，則應選至少用2種不同系統的溶劑系統展開，在薄層層析硅膠板上進行檢識，若仍顯示為單一斑點，可初步判定該化合物為單體化合物。若在薄層層析硅膠板上顯示的為多個斑點，則需繼續選用合適的硅膠、Sephadex LH-20柱色譜等分離純化手段繼續進行分離，直至點樣在硅膠層析薄層板上顯示為單一斑點。

3 實驗結果

3.1 各餾分HPLC-UV色譜圖

由圖2可知，以自制化合物1～3為對照品，HPD-100大孔樹脂的60%、70%、80%、90% EtOH/H2O洗脫部分經HPLC分析，在254 nm波長下，70%乙醇洗脫物中目標化合物峰面積較大，60%、80%乙醇洗脫物中化合物1～3峰面積均較小，而90%乙醇洗脫物中無目標化合物。

圖2 RP-HPLC-UV色譜圖Fig.2 RP-HPLC-UV chromatograms 注：A-對照品；B-60%洗脫物；C-70%洗脫物；D-80%洗脫物；E-90%洗脫物；1-貓眼草黃素；2-蒿黃素；3-槲皮萬壽菊素。Note:A-standard substances;B-60% eluate;C-70% eluate;D-80% eluate;E-90% eluate;1-CHR;2-artemetin;3-quercetagetin-3,7,3′,4′-tetramethyl ether.

3.2 精制條件確定

共得到HPD-100大孔樹脂60%洗脫部分約70 g，70%洗脫部分約99 g，80%洗脫部分約40 g，95%洗脫部分約30 g。

經硅膠柱層析100∶13餾份有黃色結晶(化合物1)，100∶15餾份有黃色結晶(2)，100∶20餾份有黃色結晶(3)，反復重結晶后，經1H NMR、13C NMR確定與文獻報道分別與artemetin(1)、CHR(2)、quercetagetin-3,7,3′,4′-tetramethyl ether(3)化學位移一致，分別得到artemetin 約1 000 mg、CHR約3 000 mg、quercetagetin-3,7,3′,4′-tetramethyl ether約500 mg(純度≥95%)。

3.3 結構確定

化合物1淡黃色結晶(丙酮)；mp.182～183 ℃；UV(MeOH)λmax(logε)253，268，350 nm； +AlCl3，260，272，365 nm；+NaOH，241，265，389 nm；+NaOCH3，245，259，393；+NaOCOCH3，255，357，410 nm；IR(KBr)νmax3 530，2 940/2 840，1 658，1 600 cm-1；1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:6.92(1H，s，H-8)，7.66(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，6.94(1H，d，J=8.5 Hz，H-5′)，7.61(1H，dd，J=8.5，2.0 Hz，H-6′)，12.62(5-OH)，9.95(4′-OH)，3.91(-OCH3)，3.72(-OCH3)，3.80(-OCH3)，3.86(-OCH3)；13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ:155.9(C-2)，137.9(C-3)，178.3(C-4)，151.9(C-5)*，131.7(C-6)，158.8(C-7)，91.6(C-8)，151.8(C-9)*(*代表可以互換)，105.7(C-10)，120.8(C-1′)，112.2(C-2′)，147.6(C-3′)，150.0(C-4′)，115.8(C-5′)，122.5(C-6′)，60.2(-OCH3)，59.8(-OCH3)，56.6(-OCH3)，55.9(-OCH3)；EI-MS:m/z375 [M+H]+，373[M-H]-。以上數據與文獻[16]中發表的光譜數據對照，基本一致，故確定為chrysoplenetin。

化合物3黃色短針狀結晶(丙酮)；mp.311～313 ℃；UV(MeOH)λmax(logε)257，274(sh)，362 nm；+NaOMe，245，304，390 nm；+AlCl3/HCl，255，308(sh)，338 nm；+AlCl3，272，435 nm；+NaOAc，286，404 nm；+NaOAc/H3BO3，263，382 nm；1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:12.60(5-OH)，5.73(6-OH)，7.72(1H，dd，J=8.6，1.8 Hz，H-6′)，7.68(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，6.96(1H，d，J=8.6 Hz，H-5′)，6.51(1H，s，H-8)，4.00(4′-OCH3)，3.96(7-OCH3)，3.92(3-OCH3)，3.88(3′-OCH3)；13C NMR(CDCl3,150 MHz)δ:178.6(C-4)，158.4(C-7)，155.2(C-2)，152.3(C-5)，151.9(C-9)，148.4(C-4′)，145.1(C-3′)，138.6(C-3)，131.9(C-6)，123.2(C-1′)，121.2(C-6′)，113.9(C-2′)，110.0(C-5′)，106.2(C-10)，89.9(C-8)，60.5(-OCH3)，59.8(-OCH3)，55.9(-OCH3)，55.7(-OCH3)；EI-MS:m/z318[M+H]+。以上數據與文獻中發表的光譜數據[18-20]對照，基本一致，故確定為quercetagetin-3,7,3′,4′-tetramethyl ether。

4 結論

本部分采用大孔樹脂、硅膠、葡聚糖凝膠、薄層層析等多種色譜手段，對青蒿素工業廢渣丙酮層進行了系統分離和純化，得到了純度大于98%的CHR(1)、artemetin(2)、quercetagetin-3，7，3′，4′-tetramethylether(3)；采用HPLC法對60%、70%、80%、90%的乙醇洗脫物進行檢測，與對照品相比發現60%的洗脫物中目標化合物峰面積較小，雜質峰較多，主要是一些苷類和極性較大的苷元。70%乙醇洗脫物中CHR 峰面積較大，同時利用70%的洗脫部分，篩選了二氯甲烷-甲醇、氯仿-丙酮、石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮4種溶劑系統，最終確定石油醚-丙酮溶劑系統，此分離系統對樣品的分離效果較好。

用大孔樹脂富集得到70%乙醇洗脫物，經反復硅膠柱層析、凝膠柱層析得到高純度的CHR單體。在青蒿素原料藥工業化生產過程中，CHR等黃酮類化合物在除雜進化過程中，被當成雜質除去了。如果能夠對青蒿素工業生廢料進行有效的循環再利用，可以變廢為寶，降低用藥成本，在資源的開發利用方面具有重要的意義。