過(guò)氧化氫法改性羊肚菌多糖研究

張雪松，謝春芹，凡軍民，曹 正，許俊齊，劉煥穎

江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院茶與食品科技學(xué)院，句容 212400

羊肚菌是一種珍稀食用菌品種，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)，藥用價(jià)值較高。近年來(lái)的研究表明食用菌多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血糖、提高人體免疫力、抑菌、抗癌等重要生物學(xué)功能[1,2]。目前，對(duì)羊肚菌多糖的研究主要集中在提取、分離純化以及抗腫瘤、抗氧化等生物活性研究[3,4]。

糖苷酶是一種可以水解糖苷鍵的酶，在糖和糖復(fù)合物的水解和合成中起著關(guān)鍵作用。目前為止，在2型糖尿病的治療藥物中，糖苷酶抑制劑因其具有毒副作用小甚至無(wú)毒，且作用溫和持久等優(yōu)點(diǎn)，得到越來(lái)越多的研究者青睞[5]。天然糖苷酶抑制劑的研究開(kāi)發(fā)在近年來(lái)已成為比較活躍的領(lǐng)域。目前，以淀粉、麥芽糖、蔗糖為底物的糖苷酶抑制劑定向篩選模型因其作用機(jī)制明確、靶向作用具體、假陽(yáng)性率低等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[6]。

從食藥用真菌中篩選天然糖苷酶抑制劑是一條極為重要的途徑，同時(shí)，不斷嘗試以分子結(jié)構(gòu)母體為模型進(jìn)行修飾改性，開(kāi)發(fā)新型、廉價(jià)、高效的降糖藥是糖苷酶抑制劑研究領(lǐng)域的研究趨勢(shì)和最終目的。近年來(lái)，已經(jīng)有學(xué)者對(duì)靈芝多糖、山茱萸多糖等深入研究并表明多糖在糖苷酶抑制劑開(kāi)發(fā)方面具有誘人的價(jià)值[7,8]。食用菌多糖被視為較為理想的來(lái)源，但由于其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的限制，其生物活性很難與藥物相比。多糖的生物活性與其糖苷鍵的類型、相對(duì)分子量、空間結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)聯(lián)性[9]，通過(guò)多糖的改性研究能夠改變其空間結(jié)構(gòu)、分子量和取代基的種類數(shù)量，從而影響抗腫瘤、抑菌、抗氧化等生物活性[10]。多糖經(jīng)過(guò)改性后其生物活性可以得到明顯提升，甚至產(chǎn)生新的生物學(xué)活性。Chen、Wang等[11,12]曾對(duì)羊肚菌多糖以及無(wú)花果多糖分別進(jìn)行乙酰化和超聲改性，乙酰化及超聲改性產(chǎn)物的抗氧化等生物活性均有所增強(qiáng)。

目前對(duì)羊肚菌多糖體外降血糖研究尚少，更是鮮有文獻(xiàn)對(duì)羊肚菌多糖改性產(chǎn)物進(jìn)行深一步的體外降血糖研究。因此，本文在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)α-淀粉酶抑制率相對(duì)較低的羊肚菌多糖進(jìn)行改性研究。在篩選羊肚菌多糖改性方法的基礎(chǔ)上，選擇過(guò)氧化氫氧化降解羊肚菌多糖，以α-淀粉酶抑制率對(duì)許多改性方法進(jìn)行研究，針對(duì)過(guò)氧化氫氧化法進(jìn)行了單因素試驗(yàn)以及響應(yīng)面分析，考察料液比、時(shí)間、pH值、溫度等因素的影響，優(yōu)化其工藝條件，進(jìn)一步提升羊肚菌多糖對(duì)糖苷酶的抑制能力，為多糖類物質(zhì)的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肚菌，江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院食用菌教學(xué)基地種植栽培。4-硝基苯基-α-D吡喃半乳糖苷、蔗糖、麥芽糖、淀粉、無(wú)水碳酸鈉、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、30%過(guò)氧化氫、乙酸酐、硫酸銨、正丁醇、酒石酸鉀鈉、氯仿均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。四種酶制劑見(jiàn)表1。

表1 酶制劑 Table 1 Enzyme preparations

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；GZLYZ-1真空冷凍干燥機(jī) 諸城市博匯機(jī)械有限公司；HWS24型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CP214電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；SY-5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Nicolet5700傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)Thermo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 羊肚菌多糖的制備

取65 ℃下烘干羊肚菌實(shí)體進(jìn)行粉碎并過(guò)40目篩，按照1∶10的比例加入蒸餾水混合攪拌，超聲波功率為400 W，55 ℃提取45 min。提取液4 ℃靜置12 h后經(jīng)過(guò)濾，離心得上清液。上清液水浴濃縮后，Sevag法離心除蛋白。上清液按6倍量加入無(wú)水乙醇，-20 ℃靜置12 h。收集沉淀，真空冷凍干燥后得到羊肚菌多糖。

1.3.2 羊肚菌多糖改性物制備

1.3.2.1 鹽酸水解法制備羊肚菌多糖改性物

稱取羊肚菌多糖0.1 g，加入2 mol/L鹽酸溶液10 mL，90 ℃保溫3 h。氫氧化鈉調(diào)pH至中性。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.3.2.2 過(guò)氧化氫氧化降解法制備羊肚菌多糖改性物

稱取羊肚菌多糖1 g，加入5 mL過(guò)氧化氫后用蒸餾水定容至25 mL，40 ℃水浴保溫3 h。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.3.2.3α-淀粉酶酶解法制備羊肚菌多糖改性物

稱取羊肚菌多糖1 g，加入40 U/mL、pH6的α-淀粉酶25 mL，50 ℃水浴保溫15 min。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.3.2.4 乙酰化法制備羊肚菌多糖改性物

稱取羊肚菌多糖1 g，加入30 mL蒸餾水，用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)至pH9，按照料液比1∶4加入乙酸酐，50 ℃水浴保溫1 h。用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至中性。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.3.2.5 硫酸化法制備羊肚菌多糖改性物

稱取羊肚菌多糖1 g，按照料液比1∶8(g/mL)加入濃硫酸，繼續(xù)加入0.1 g硫酸銨，正丁醇2.5 mL，放入冰水浴中反應(yīng)1 h。用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至中性。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.3.2.6 超聲波法制備羊肚菌多糖改性物

稱取羊肚菌多糖1 g，按照料液比1∶50加入蒸餾水，超聲功率300 W，溫度90 ℃， 超聲時(shí)間20 min。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.3.3 糖苷酶抑制率的測(cè)定

1.3.3.1α-淀粉酶抑制率的測(cè)定

樣品溶液的配制：取0.2 g樣品加入蒸餾水配制成濃度為40 mg/L樣品溶液。

α-淀粉酶抑制率的測(cè)定參照文獻(xiàn)[13]略加改動(dòng)。加入2%淀粉溶液0.5 mL，在抑制管和抑制對(duì)照管中加入1.0 mL、40 mg/L樣品溶液，在空白管和空白對(duì)照管中加入1.0 mL蒸餾水進(jìn)行對(duì)照，再在空白管和抑制劑管加入0.5 mL、20 U/mLα-淀粉酶，對(duì)照管加入0.5 mL蒸餾水。置于37 ℃水浴中反應(yīng)10 min后，加入1.0 mL DNS，再放入沸水浴中反應(yīng)5 min，加入10.0 mL蒸餾水，冷卻至室溫，于540 nm處測(cè)其吸光值，得A。

式中，Α1、Α2、Α3和Α4分別為540 nm下空白管、空白對(duì)照管、抑制管和抑制對(duì)照管的吸光值。

1.3.3.2 麥芽糖酶抑制率的測(cè)定方法

麥芽糖酶抑制率的測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]略加改動(dòng)。加入2%麥芽糖溶液0.5 mL，在抑制管和抑制對(duì)照管中加入1.0 mL、40 mg/L樣品溶液，在空白管和空白對(duì)照管中加入1.0 mL蒸餾水進(jìn)行對(duì)照，再在空白管和抑制劑管加入0.5 mL、20 U/mL麥芽糖酶，對(duì)照管加入0.5 mL蒸餾水。置于37 ℃水浴中反應(yīng)10 min后，加入1.0 mL DNS，于沸水浴中反應(yīng)5 min，加入10.0 mL蒸餾水，冷卻至室溫，于405 nm處測(cè)定吸光值，得A。

式中，Α1、Α2、Α3和Α4分別為為405 nm下空白管、空白對(duì)照管、抑制管和抑制對(duì)照管的吸光值。

1.3.3.3 α-葡萄糖苷酶抑制率的測(cè)定方法

α-葡萄糖苷酶抑制率的測(cè)參照文獻(xiàn)[15]略加改動(dòng)。加入4-硝基苯基-α-D吡喃半乳糖苷(PNPG)溶液2.0 mL，在抑制管和抑制對(duì)照管中加入1.0 mL、40 mg/L的樣品溶液，在空白管和空白對(duì)照管中加入1.0 mL蒸餾水進(jìn)行對(duì)照，再加入2.0 mL磷酸鹽緩沖溶液。置于37 ℃水浴中保溫10 min，在空白管以及抑制管加入1.0 mL、20 U/mLα-葡萄糖苷酶，在對(duì)照管加入1.0 mL蒸餾水。再次放入37 ℃水浴中保溫15 min，加入5.0 mL碳酸鈉溶液終止試驗(yàn)。冷卻至室溫，于405 nm處測(cè)得吸光值，得A。

式中，Α1、Α2、Α3和Α4分別為405 nm下空白管、空白對(duì)照管、抑制管和抑制對(duì)照管的吸光值。

1.3.3.4 蔗糖酶抑制率的測(cè)定方法

蔗糖酶抑制率的測(cè)定參照文獻(xiàn)[16]略加改動(dòng)。加入2%蔗糖溶液0.5 mL，在抑制管和抑制對(duì)照管中加入1.0 mL、40 mg/L抑制劑，在空白管和空白對(duì)照管中加入1.0 mL蒸餾水進(jìn)行對(duì)照，再在空白管和抑制劑管加入0.5 mL、20 U/mL蔗糖酶，對(duì)照管加入0.5 mL蒸餾水。置于37 ℃水浴中反應(yīng)10 min后，加入1.0 mL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)，于沸水浴中反應(yīng)5 min，加入10.0 mL蒸餾水，冷卻至室溫，于550 nm處測(cè)定吸光值，得A。

式中，Α1、Α2、Α3和Α4分別為550 nm下空白管、空白對(duì)照管、抑制管和抑制對(duì)照管的吸光值。

1.4 傅里葉變換紅外光譜分析

將樣品磨成粉末，與溴化鉀混合后一起壓片，得到均勻的薄片進(jìn)行測(cè)試。掃描范圍為4 000～500 cm-1。

1.5 單因素試驗(yàn)

1.5.1 時(shí)間對(duì)改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響

稱取1 g樣品加入5 mL、30%過(guò)氧化氫溶液，加入pH7的磷酸鹽緩沖溶液定容至25 mL，在40 ℃下分別反應(yīng)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 h。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.5.2 料液比對(duì)改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響

稱取1 g樣品，按料液比1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11和1∶13加入30%過(guò)氧化氫溶液，加入pH7的磷酸鹽緩沖溶液定容至25 mL，在40 ℃下反應(yīng)3 h。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.5.3 反應(yīng)溫度對(duì)改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響

稱取1 g樣品，加入料液比為1∶9的30%過(guò)氧化氫溶液，加入pH7的磷酸鹽緩沖溶液定容至25 mL，在20、30、40、50、60 ℃條件下，反應(yīng)3 h。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.5.4 pH對(duì)改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響

稱取1 g樣品，加入料液比為1∶9的30%過(guò)氧化氫溶液溶解樣品，加入pH分別為5、6、7、8、9的磷酸鹽緩沖溶液定容至25 mL，在50 ℃下反應(yīng)3 h。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-expert進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。以α-淀粉酶抑制率為衡量指標(biāo)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平如表2所示，表2中時(shí)間、料液比、溫度、pH四因素分別對(duì)應(yīng)試驗(yàn)因素中的A、B、C、D。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表 Table 2 Factor level of response surface experiments

2 結(jié)果與討論

2.1 羊肚菌多糖改性方法篩選

不同改性方法對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，鹽酸水解法、過(guò)氧化氫氧化降解法、α-淀粉酶酶解法、乙酰化法以及超聲波法均能提高羊肚菌多糖改性產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制率，而采用濃硫酸處理則沒(méi)有效果。研究表明多糖的生物活性與其糖苷鍵的類型、相對(duì)分子量、空間結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)聯(lián)性[9]。用鹽酸、過(guò)氧化氫以及α-淀粉酶處理羊肚菌多糖，可使其發(fā)生降解，降低了多糖分子量，這可能有助于提升對(duì)α-淀粉酶的抑制能力。乙酰化則是在多糖酚羥基中引入乙酰基，改變多糖的空間結(jié)構(gòu)。而超聲波能夠破壞空間結(jié)構(gòu)，降解大分子物質(zhì)，降低分子量[17]。硫酸化處理羊肚菌多糖，其改性產(chǎn)物對(duì)α-淀粉酶的抑制能力有所下降，這可能是濃硫酸使得多糖發(fā)生碳化和氧化[18]。在六種改性方法中，過(guò)氧化氫法制備羊肚菌多糖改性產(chǎn)物對(duì)α-淀粉酶抑制率提升效果最高，在試驗(yàn)條件下可提高約14倍，故選擇過(guò)氧化氫法氧化降解羊肚菌多糖。

圖1 不同改性方法的影響Fig.1 Effect of different modification method of Morchella polysaccharide 注：圖中橫坐標(biāo)1表示羊肚菌多糖初始α-淀粉酶抑制率， 2-7分別表示羊肚菌多糖經(jīng)鹽酸水解、過(guò)氧化氫氧化降解、α-淀粉酶酶解、乙酰化、硫酸化以及超聲波處理后的改性產(chǎn)物對(duì)α-淀粉酶的抑制率。Note:Number 1 of abscissa indicates the initial α-amylase inhibition rate of Morchella polysaccharides,and number 2-7 indicates α-amylase inhibition rate of the Morchella polysaccharides modified product by hydrochloric acid,hydroperoxide degradation,α-amylase enzymatic hydrolysis,acetylation,sulfation and ultrasonic treatment.

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)羊肚菌多糖改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，羊肚菌多糖改性產(chǎn)物對(duì)α-淀粉酶的抑制率逐漸升高，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為3 h時(shí)抑制率達(dá)到最大。超過(guò)3 h后，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間則抑制率趨于平緩。

2.2.2 料液比對(duì)改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響

料液比對(duì)羊肚菌多糖改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響Fig.2 Effect of reaction time on inhibition rate of α-amylase

率的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著料液比的逐漸增加，羊肚菌多糖改性產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制率先升高后降低，當(dāng)料液比為1∶9時(shí)抑制率達(dá)到最大。過(guò)氧化氫量越多，會(huì)提供更多的羥基自由基，多糖的降解程度就越大。同時(shí)過(guò)氧化氫的過(guò)度氧化作用會(huì)使C-O-C發(fā)生斷裂，使得分子量進(jìn)一步降低，從而導(dǎo)致α-淀粉酶抑制率降低[19]。

圖3 料液比對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on inhibition rate of α-amylase

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on inhibition rate of α-amylase

2.2.3 反應(yīng)溫度對(duì)改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響

反應(yīng)溫度對(duì)羊肚菌多糖改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著溫度的逐漸升高，羊肚菌多糖改性產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制率出現(xiàn)先增大后減小，在50 ℃條件下抑制率達(dá)到最大。這可能是由于過(guò)氧化氫不穩(wěn)定，高溫下易降解，從而降低了氧化能力。

2.2.4 pH對(duì)改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響

pH對(duì)羊肚菌多糖改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著pH的逐漸升高，羊肚菌多糖改性產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制率先升高后降低，pH7時(shí)抑制率最大。過(guò)氧化氫雖然在酸性條件下顯示出更強(qiáng)的氧化性，但是過(guò)度的氧化可能會(huì)導(dǎo)致羊肚菌多糖改性物的分子量進(jìn)一步變化，同時(shí)其羥基氧化成羧基的可能性也大大增強(qiáng)。在堿性環(huán)境下會(huì)降低其穩(wěn)定性，并且抑制過(guò)氧化氫的氧化性，從而降低了改性產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制能力。

圖5 pH對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響Fig.5 Effect of pH on the inhibitory rate of α-amylase

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及分析

羊肚菌多糖改性響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 Table 3 Response experimental results

續(xù)表3(Continued Tab.3)

序號(hào)Serial numberABCDα-淀粉酶抑制率α-Amylase inhibition rate(%)400-1-18.45-100-18.58601-1010.75701109.44810-1011.959000015.72100-10-18.7111-1-10013.55120-10111.2113100111.0714000016.2815-110011.9616110011.4617000015.94180-1-1013.0619001-17.0820-10109.872100117.0422-10-1012.7123-10019.57241-10013.04250-11010.022600-1110.8927010-18.642801018.6129000016.06

2.3.1 方差分析

運(yùn)用Design-Expert V8.0軟件對(duì)表3響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

表4 響應(yīng)面二次模型方差分析 Table 4 Response surface quadratic model analysis of variance

續(xù)表4(Continued Tab.4)

方差來(lái)源Source平方和Sum of squares自由度df均方和Mean squareF值F valueP值 概率﹥FP value Prob>FAC0.4010.403.130.098 5AD0.3010.302.310.151 0BC0.7510.755.810.030 2BD1.6011.6012.430.003 4CD1.6011.6012.430.003 4A218.17118.17141.14﹤0.000 1B226.17126.17203.30﹤0.000 1C262.98162.98489.30﹤0.000 1D2144.271144.271 120.77﹤0.000 1殘差Residual1.80140.13失擬項(xiàng)Lack of fit1.59100.163.030.148 3 not significant純誤差 Pure error0.2140.053總誤差 Cor total216.6128

從表4所示的方差分析來(lái)看，所選擇的模型顯著(P<0.05)，失擬項(xiàng)為不顯著(P>0.05)，即所選擇的模型可靠。在時(shí)間、料液比、溫度以及pH四個(gè)因素中，料液比、溫度以及pH的影響皆顯著。此外，這四個(gè)因素對(duì)羊肚菌多糖改性產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制率的影響亦非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。各個(gè)因素之間的交互影響表現(xiàn)為顯著的有料液比-溫度、料液比-pH、溫度-pH。

表5 R2綜合分析表 Table 5 Analysis of R-squared

從表5可以看出，模型的R2=0.991 7，校正R2=0.983 4，預(yù)測(cè)R2和校正R2較為接近，信噪比為34.981(﹥4)，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，試驗(yàn)誤差較小，故可用此模型對(duì)多糖改性的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化和預(yù)測(cè)。

利用Design Expert V8.0軟件對(duì)表5所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，獲得改性多糖的多元二次回歸方程模型為：α-淀粉酶抑制率=16.05+0.054×A-0.73×B-1.16×C+0.67×D+2.500×10-3×A×B+0.32×A×C+0.27×A×D+0.43×B×C-0.63×B×D-0.63×C×D-1.67×A2-2.01×B2-3.12×C2-4.72×D2。

2.3.2 響應(yīng)曲面圖及其等高線圖

根據(jù)回歸方程，考察兩兩因素之間的交互作用對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響，可得一組等高線圖及其響應(yīng)曲面圖(圖6～圖8)，從而確定因素的最佳水平范圍，結(jié)果選擇影響顯著的BC、BD和CD加以說(shuō)明。

2.3.2.1 料液比-溫度對(duì)α-淀粉酶抑制率的交互影響

圖6為料液比-溫度對(duì)改性多糖α-淀粉酶抑制率的等高線圖及其響應(yīng)曲面圖。當(dāng)時(shí)間和pH為最佳值時(shí)，隨著料液比和溫度的增加，改性多糖的α-淀粉酶抑制率均出現(xiàn)顯著的變化，抑制能力先增大后減小。由圖可以確定最佳水平范圍料液比在7.92～9.28之間，溫度在45.21～50.42 ℃之間。

圖6 料液比-溫度對(duì)α-淀粉酶抑制率的響應(yīng)曲面圖(左)和等高線圖(右)Fig.6 Response of material-liquid ratio-to-temperature to α-amylase inhibition rate surface plot (left) and contour plot (right)

2.3.2.2 料液比-pH對(duì)α-淀粉酶抑制率的交互影響

圖7為料液比-pH對(duì)改性多糖α-淀粉酶抑制率的等高線圖及其響應(yīng)曲面圖。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度為最佳值時(shí)，隨著料液比和pH的增加，改性多糖的α-淀粉酶抑制率均出現(xiàn)顯著的變化，抑制能力先增大后減小。由圖可知，最佳料液比在8.06～9.14之間，pH在6.86～7.25之間。

圖7 料液比-pH對(duì)α-淀粉酶抑制率的響應(yīng)曲面圖(左)和等高線圖(右)Fig.7 Response of material-liquid ratio-to-pH to α-amylase inhibition rate surface plot (left) and contour plot (right)

2.3.2.3 溫度-pH對(duì)α-淀粉酶抑制率的交互影響

圖8為溫度-pH對(duì)改性多糖α-淀粉酶抑制率的等高線圖及其響應(yīng)曲面圖。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間和料液比為最佳值時(shí)，隨著溫度和pH的增加，改性多糖的α-淀粉酶抑制率均出現(xiàn)顯著的變化，抑制能力先增大后減小。由圖可以確定最佳溫度在45.55～50.55 ℃之間，pH在6.83～7.29之間。

圖8 溫度-pH對(duì)α-淀粉酶抑制率的響應(yīng)曲面圖(左)和等高線圖(右)Fig.8 Response of temperature-to-pH to α-amylase inhibition rate surface plot (left) and contour plot (right)

2.3.3 最優(yōu)條件預(yù)測(cè)

通過(guò)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析得出模型理論最佳條件為料液比為1∶8.55、pH7.09、溫度為47.8 ℃、時(shí)間為3.02 h，按最優(yōu)條件進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，重復(fù)測(cè)定三次所得羊肚菌改性產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制率為16.30%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果的相對(duì)誤差為0.11%，兩值相近，說(shuō)明此模型預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)可靠。

2.4 改性前后對(duì)糖苷酶抑制率的比較

改性前后對(duì)糖苷酶抑制率的比較見(jiàn)圖9。由圖9可知，利用過(guò)氧化氫氧化法對(duì)羊肚菌多糖進(jìn)行改性，改性羊肚菌多糖α-淀粉酶抑制率有顯著提高(P﹤0.05)。改性后與改性前相比，α-淀粉酶抑制率提高了17.16倍。蔗糖酶抑制率由72.08%提高到78.13%，麥芽糖酶抑制率由10.05%提高到16.48%，α-葡萄糖苷酶由17.54%提高到21.40%。改性產(chǎn)物與同濃度下的阿卡波糖相比，α-淀粉酶抑制率提高了1.44倍，蔗糖酶抑制率與阿卡波糖無(wú)明顯差異(P>0.05)，麥芽糖酶抑制率提高了1.63倍，α-葡萄糖苷酶抑制率提高了1.88倍。

圖9 改性前后糖苷酶抑制率的比較Fig.9 Comparison of inhibition rate of glycosidase before and after modification 注：圖中橫坐標(biāo)1～4分別表示α-淀粉酶抑制率、蔗糖酶抑制率、麥芽糖酶抑制率以及α-葡萄糖苷酶抑制率。Note:Number 1-4 of abscissa indicates the α-amylase inhibition rate,sucrase inhibition rate,maltase inhibition rate and α-glucosidase inhibition rate.

2.5 改性前后樣品表征

羊肚菌多糖改性前后的傅里葉紅外光譜圖見(jiàn)圖10。分析圖譜可以看出，羊肚菌多糖經(jīng)過(guò)氧化氫改性前后的紅外圖譜基本吻合，官能團(tuán)種類基本沒(méi)有發(fā)生變化，呈現(xiàn)明顯的多糖吸收特征。說(shuō)明羊肚菌多糖經(jīng)過(guò)氧化氫氧化降解后，化學(xué)結(jié)構(gòu)單元不發(fā)生變化，僅糖苷鍵發(fā)生斷鍵，分子量降低。在3 420cm-1處出現(xiàn)-OH伸縮振動(dòng)吸收峰，2 928 cm-1為C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，1 635 cm-1處出現(xiàn)-OH彎曲振動(dòng)吸收峰，1 410 cm-1處出現(xiàn)=CH2的變形吸收峰，1 152 cm-1處出現(xiàn)環(huán)上C-O吸收峰，1 078 cm-1處醇羥基的變角振動(dòng)峰，1 026 cm-1處出現(xiàn)了糖環(huán)C-O-C吸收峰。926 cm-1處出現(xiàn)了呋喃環(huán)的對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，說(shuō)明羊肚菌多糖及其氧化改性物中有呋喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)。

圖10 改性前后樣品傅里葉變換紅外光譜分析Fig.10 FT-IR chromatographic before and after modification

3 結(jié)論

本文采用過(guò)氧化氫氧化降解法對(duì)羊肚菌多糖進(jìn)行改性，考察了四個(gè)因素(反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、料液比、pH)對(duì)改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響。利用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，建立了四個(gè)因素相互作用的數(shù)學(xué)預(yù)測(cè)模型，預(yù)測(cè)模型表明，料液比1∶8.55、pH7.09、溫度47.8 ℃、時(shí)間3.02 h為最佳反應(yīng)條件。試驗(yàn)所得改性多糖α-淀粉酶抑制率為16.30%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果的相對(duì)誤差為0.11%，比改性前提高了17.16倍，蔗糖酶抑制率提高了1.07倍，麥芽糖酶抑制率提高了1.64倍，α-葡萄糖苷酶抑制率提高了1.22倍。與常用的降糖藥阿卡波糖相比，羊肚菌多糖改性產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制率、麥芽糖酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率分別提高了1.44、1.63和1.88倍。

多糖類化合物是由至少超過(guò)十個(gè)的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，其糖苷酶抑制率與化合物的結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系。目前雖然有一些關(guān)于羊肚菌多糖的化學(xué)改性研究，如Chen[11]曾利用乙酸酐法、氯磺酸-吡啶法以及硫酸化法等化學(xué)改性法對(duì)羊肚菌多糖改性后的抗腫瘤、抗氧化等活性進(jìn)行了比較。但是鮮有文獻(xiàn)對(duì)羊肚菌多糖改性產(chǎn)物進(jìn)行深一步的體外降血糖研究。氧化是多糖的化學(xué)改性中最為簡(jiǎn)單和廣泛的方法之一，其降解原理是打斷多糖分子內(nèi)的糖苷鍵，從而使大分子變成小分子多糖。以無(wú)副產(chǎn)物、無(wú)毒害作用的過(guò)氧化氫氧化降解法開(kāi)發(fā)得最多[20]。同時(shí)，過(guò)氧化氫氧化改性較硫酸化法等化學(xué)改性操作更為簡(jiǎn)便，更為高效，并且不產(chǎn)生任何有毒有害的副產(chǎn)物，綠色環(huán)保，因此在生產(chǎn)中可以得到有效利用。本文優(yōu)化過(guò)氧化氫氧化降解羊肚菌多糖工藝條件，進(jìn)一步提升羊肚菌多糖對(duì)糖苷酶的抑制能力，為降糖藥的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。