山西與內蒙產蒙古黃芪的ISSR體系優(yōu)化及遺傳多樣性分析

崔 潔，王丹丹，王倩玉，陳彤垚，張福生*，秦雪梅*

1山西大學中醫(yī)藥現代研究中心；2山西大學化學化工學院；3山西大學地產中藥功效物質研究與利用山西省重點實驗室，太原 030006；4石家莊四藥有限公司，石家莊 050021

黃芪為傳統大宗中藥材之一，豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌之功效[1]，素有“十藥八芪”之稱。黃芪為多基原植物，目前市場上的流通商品藥材主要為蒙古黃芪的栽培品，且栽培品主要來源于山西、甘肅、內蒙古等地，其中，山西、內蒙古主要為種子直播，多采取仿野生的生長方式，而甘肅則為育苗移栽的生長方式。目前，黃芪的栽培品存在以下幾個問題：首先，黃芪的種子來源不一，人為過度干預造成種質退化；其次，生長方式不同使得黃芪的外觀性狀[2-4]與內在化學成分含量發(fā)生了較明顯的變化[5-7]，而這些又可能會對臨床上的藥效強弱產生一定影響。因此，我們需要對黃芪的遺傳變異進行分析，便于對黃芪的種質進行復壯，并對生長方式進行考察，以期達到規(guī)范栽培管理。本文以山西與內蒙古的8批蒙古黃芪為例，優(yōu)化了蒙古黃芪ISSR反應體系；同時對傳統道地產區(qū)的山西與內蒙古產蒙古黃芪進行了種質遺傳多樣性與遺傳距離的分析，為黃芪種質資源的保護及蒙古黃芪優(yōu)良品種的挖掘奠定基礎。

簡單重復序列間擴增(inter-simple sequence repeat，ISSR)分子標記是在1994年建立的一種分子標記技術，可用于種質資源遺傳多樣性分析、親緣關系、品種鑒定與品種選育等[8]，如Tang等[9]菊科的40份種質進行了ISSR遺傳多樣性研究；Wang等[10]運用ISSR分子標記結合相關分析技術，設計了快速預測遠志藥材樣品中tenuifoliside C含量高低的特異性引物；Yang等[11]根據psbA/trnH基因間區(qū)域的核酸序列與ISSR擴增結果，設計了SCAR標記的引物15F/15R，其可用于鑒別韓國黃芪以及從中國進口的黃芪。

Zhang[12]優(yōu)化了影響黃芪ISSR體系的以下因素：DNA用量、dNTPs濃度、Taq酶用量、引物濃度。本實驗不僅對以上因素進行了優(yōu)化，還對激活Taq酶和影響退火溫度的Mg2+濃度，PCR擴增的循環(huán)次數進行了優(yōu)化，同時在此優(yōu)化的體系下，對8批蒙古黃芪進行了遺傳多樣性分析。以期為蒙古黃芪種質資源的評價提供技術支持，促進蒙古黃芪種質保護及良種選育等工作的進一步開展。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

TC-XP-D基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)，DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠)，ZF-258全自動凝膠成像分析系統(上海嘉鵬科技有限公司)，TGL-16高速臺式冷凍離心機(湘儀離心機)，XW-80A旋渦混合器(上海精科實業(yè)有限公司)，NanoDrop 2000 超微量分光光度計(Thermo公司)，移液器(Eppendorf)。

1.2 試劑

Biowest瓊脂糖、β-巰基乙醇均購于太原灝洋生物科技有限公司；GoldView I型核酸染色劑，Solarbio公司；DL 2000 DNA Marker、6×Loading Buffer、PCR試劑盒，TaKaRa公司；CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒(貨號：DN14，50次)，北京艾德萊生物科技有限公司；實驗所用到的引物根據大不列顛哥倫比亞大學(UBC)公布的100對ISSR引物序列進行引物合成，由大連寶生物(TaKaRa)公司合成；三氯甲烷、異戊醇、無水乙醇、硼酸等試劑，國產分析純。

1.3 藥材樣本采集

本實驗所用黃芪樣本，主要采集于山西省以及內蒙古自治區(qū)，經山西大學中醫(yī)藥現代研究中心的秦雪梅教授鑒定為蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao)，存放于山西大學中醫(yī)藥現代研究中心標本室。詳細信息見表1。

表1 黃芪樣品信息表Table 1 Information of A.membranaceus sample source

續(xù)表1

編號No.采集地Collection place簡稱Abbreviation生長方式Growth mode6山西省忻州市五寨縣丘陵坡地山西五寨丘陵坡地半野生7山西省忻州市五寨縣山西五寨栽培(平地移栽)8山西省大同市渾源縣官兒鄉(xiāng)木溝村麻黃溝山西渾源官兒鄉(xiāng)野生

2 方法

2.1 基因組DNA的提取與檢測

依據CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒的操作步驟進行實驗，提取所有黃芪樣本的DNA，并用1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的完整性，同時用NanoDrop 2000 超微量分光光度計檢測其濃度和純度。

2.2 ISSR-PCR初始反應條件及擴增程序

參考相關文獻[12-17]，確定黃芪ISSR-PCR初始反應條件為：總體積20 μL，包含10×PCR Buffer 2 μL、2.5 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L dNTPs、0.4 μmol/L引物、1.5 UTaqDNA聚合酶、DNA模板約20 ng，以ddH2O補齊體積至20 μL。反應程序為：94 ℃充分變性5 min，94 ℃變性45 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)后，最后72 ℃延伸10 min。反應結束后，取PCR反應液5 μL，加2 μL的6×Loading Buffer，在1.5 %瓊脂糖凝膠上電泳，電壓105 V，電泳30～40 min，在凝膠成像儀上觀察并照相記錄。

2.3 ISSR-PCR反應體系優(yōu)化設計

以2號黃芪的基因組DNA為模板，用ISSR-PCR初始反應體系及擴增程序對引物UBC825進行擴增，結果出現多態(tài)性條帶，但條帶不夠清晰，甚至出現拖尾及非特異性擴增的條帶，因此，在此初始反應體系的基礎上采用單因素實驗設計，依據①dNTP→②引物→③MgCl2→④Taq酶用量→⑤DNA用量→⑥退火溫度→⑦循環(huán)次數的順序對影響黃芪ISSR-PCR反應的各個因素分別設置了不同水平的處理，具體實驗過程如下所示：(1)dNTPs：0.2、0.4、0.47、0.54、0.6 mmol/L；(2)引物：0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.6 μmol/L；(3)MgCl2：1.2、2.4、3.0、3.5、4.0 mmol/L；(4)Taq酶：1.0、1.5、2.0 U；(5)DNA：20、40、50、60、70、80 ng；(6)退火溫度：根據Tm=4(G+C)+2(A+T)確定該值，以該值為基礎上下浮動6 ℃，確定出退火溫度的范圍，在PCR儀上進行梯度退火篩選；(7)循環(huán)次數：25、28、30次。

2.4 ISSR-PCR引物的篩選

參照大不列顛哥倫比亞大學(University of British Columbia，UBC)所設計的ISSR引物序列，將8批樣品的DNA等質量混合后進行引物的篩選以及退火溫度的優(yōu)化，最終確定14條擴增重復性好、條帶清晰的引物，用于全部樣本的擴增。

2.5 8批黃芪樣品的遺傳一致度及遺傳距離分析

遺傳一致度(I)反映的是兩個樣品親緣關系的遠近程度，親緣關系越接近，種群在所有位點的等位基因就越多，遺傳一致度就越接近1，反之，遺傳一致度就越接近0。遺傳距離(D)反映的是兩個樣品的遺傳變異程度，遺傳變異越大，遺傳距離越接近1，反之，遺傳距離越接近0。當I=1，D=0時，表示兩樣品的所有等位基因位點完全一致；當I=0，D=∞時，表示兩樣品的等位基因位點完全不一致。本研究所采用的遺傳一致度I與遺傳距離D均由軟件POPGENE version 1.32采用Nei的標準計算方法而得。

3 結果與分析

3.1 ISSR-PCR反應體系優(yōu)化的結果

3.1.1 dNTPs濃度的優(yōu)化結果

本實驗先對dNTPs設置了3個濃度，分別為0.2、0.4、0.6 mmol/L，見圖1A。dNTPs在低濃度(0.2 mmol/L)的情況下，擴增產率低且條帶模糊；dNTPs濃度為0.4和0.6 mmol/L時條帶較清晰；所以在0.4-0.6 mmol/L之間設置了梯度進行進一步細化，細化濃度分別為0.4、0.47、0.54、0.6 mmol/L，見圖1B。結果發(fā)現在0.54 mmol/L時條帶最為清晰，之后將其濃度設置為0.5 mmol/L時也能達到0.54 mmol/L相同的效果，本著節(jié)約的原則，所以dNTPs的濃度最終確定為0.5 mmol/L。

圖1 不同濃度dNTPs的ISSR-PCR擴增電泳圖Fig.1 Electrophoresis of ISSR-PCR with different concentrations of dNTPs 注：1～3 dNTPs的濃度分別為0.2、0.4、0.6 mmol/L；4～7 dNTPs的濃度分別為0.4、0.47、0.54、0.6 mmol/L；M：DL 2000 DNA Marker。Note:The concentrations of 1-3 dNTPs were 0.2、0.4、0.6 mmol/L,respectively;the concentrations of 4-7 dNTPs were 0.4、 0.47、0.54、0.6 mmol/L,respectively.M：DL 2000 DNA marker.

3.1.2 引物濃度的篩選結果

本實驗對引物濃度先設置了3個梯度，分別為0.2、0.4、0.6 μmol/L，見圖2A。PCR結果發(fā)現在0.2、0.4 μmol/L時條帶差不多且清晰，高濃度(0.6 μmol/L)時條帶變模糊。所以在0.2、0.4 μmol/L之間設置了不同濃度進行細化，細化濃度分別為0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 μmol/L，見圖2B。結果發(fā)現引物濃度0.25 μmol/L時條帶清晰且擴增穩(wěn)定。所以引物最終濃度為0.25 μmol/L。

圖2 引物(UBC825)不同濃度的ISSR-PCR電泳圖Fig.2 Electrophoresis of ISSR-PCR with different concentrations of primer UBC825 注：1～3 引物濃度分別為0.2、0.4、0.6 μmol/L；4～8 引物濃度分別為0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 μmol/L；M：DL 2000 DNA marker。Note:1-3 primer concentrations were 0.2、0.4、0.6 μmol/L;4-8 primer concentrations were 0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 μmol/L, respectively.M：DL 2000 DNA marker.

3.1.3 MgCl2濃度的優(yōu)化結果

本實驗對MgCl2設置了3個濃度，分別為1.2、2.4、3.6 mmol/L，見圖3A。結果發(fā)現，當MgCl2濃度為低濃度(1.2 mmol/L)時PCR產物條帶少且模糊，當濃度為2.4 mmol/L時條帶比1.2 mmol/L清晰；當MgCl2濃度為3.6 mmol/L時PCR擴增條帶多且較清晰。所以接下來在2.4-3.6 mmol/L之間分別設置了以下濃度：2.5、3.0、3.5、4.0 mmol/L，結果如圖3B。當MgCl2濃度為高濃度(4.0 mmol/L)時，條帶變模糊；MgCl2濃度為2.5 mmol/L時條帶數少且不清晰；3.5 mmol/L時條帶清晰度比3.0 mmol/L時的好，所以選擇3.5 mmol/L作為MgCl2的終濃度。

圖3 不同MgCl2 濃度的ISSR-PCR 擴增結果瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis map optimized for the concentration of different MgCl2 注：1～3 MgCl2濃度分別為1.2、2.4、3.6 mmol/L；4～7 MgCl2濃度分別為：2.5、3.0、3.5、4.0 mmol/L；M:DL 2000 DNA marker。Note:1-3 The concentrations of MgCl2 were 1.2、2.4、3.6 mmol/L,respectively;the concentrations of 4-7 MgCl2 were 2.5、3.0、3.5、4.0 mmol/L,respectively.M:DL 2000 DNA marker.

3.1.4Taq酶用量的優(yōu)化結果

在確定了dNTPs，引物，MgCl2濃度的情況下，對Taq酶量進行了考察，設置濃度為1.0、1.5、2.0 U，結果如圖4所示，1.0、1.5、2.0 UTaq酶條帶相似，但出于經濟考慮最終確定Taq酶量為1.0 U。

圖4 不同用量Taq酶的 ISSR-PCR 擴增電泳圖Fig.4 Electrophoresis of ISSR-PCR with different amounts of Taq polymerase 注：1～3 Taq酶用量分別為1.0、1.5、2.0 U；M：DL 2000 DNA marker。Note:1-3 Taq enzyme amounts were 1.0、1.5、2.0 U, respective-ly.M:DL 2000 DNA marker.

3.1.5 DNA模板量的優(yōu)化結果

DNA加入量分別為20、40、60 ng，如圖5A所示。結果發(fā)現，DNA用量在20 ng是擴增條帶模糊；當DNA用量為40和60 ng時條帶較清晰，所以在40、60 ng附近進行DNA細化，設置濃度為40、50、60、70、80 ng，結果如圖5B。在20 μL體系中，50～80 ng擴增出的條帶最為清晰，基于相同條件下模板量少原則，最終選擇DNA模板量為50 ng。

圖5 不同用量DNA模板的ISSR-PCR擴增結果Fig.5 Electrophoresis of ISSR-PCR with different amounts of DNA template 注：1～3 DNA模板用量分別為20、40、60 ng；4～8 DNA模板用量分別為40、50、60、70、80 ng；M：DL 2000 DNA marker。Note:1-3 DNA template amounts is 20、40、60 ng;4-8 DNA template amounts is 40、50、60、70、80 ng.M:DL 2000 DNA marker.

3.1.6 ISSR-PCR退火溫度的篩選結果

以引物UBC825進行梯度退火溫度篩選為例，其Tm=4(G+C)+2(A+T)，為50 ℃，設置中心溫度為51 ℃，梯度寬度為6 ℃，選擇47.6、50.5、53.2、55.8 ℃進行PCR擴增，結果如圖6。由圖6可知，引物UBC825在47.6和50.5 ℃擴增條帶模糊，53.2 ℃擴增條帶清晰，55.8 ℃條帶變模糊，所以UBC825退火溫度最終選擇53.2 ℃。

圖6 UBC825引物不同退火溫度下的ISSR-PCR電泳圖Fig.6 Electrophoresis of ISSR-PCR with different concentrations of Primer UBC825 注：1～4退火溫度分別為47.6、50.5、53.2、55.8 ℃；M：DL 2000 DNA marker。Note:1-4 Annealing temperatures are 47.6、50.5、 53.2、55.8 °C.M:DL 2000 DNA marker.

3.1.7 ISSR-PCR循環(huán)次數的篩選結果

如圖7所示，本實驗分別進行了25、28、30次的PCR擴增，結果循環(huán)次數為25次時擴增產物條帶模糊，28次，30次循環(huán)時，產物條帶基本相同，為節(jié)約時間，最終循環(huán)次數選擇28次。

圖7 不同循環(huán)次數下的ISSR-PCR擴增電泳圖Fig.7 Electrophoresis of ISSR-PCR with different cycles 注：1～3 ISSR-PCR循環(huán)次數分別為25、28、30次；M：DL 2000 DNA marker。Note:1-3 ISSR-PCR cycle times are 25、28、30 times； M:DL 2000 DNA marker.

最終確定反應體系為：總體積20 μL，包含10×PCR Buffer 2 μL、0.5 mmol/L dNTPs、1.0 UTaq酶、3.5 mmol/L MgCl2、0.25 μmol/L引物、50 ng DNA，加ddH2O水補足至20 μL。反應程序為：94 ℃充分變性5 min，94 ℃變性45 s，53 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，28個循環(huán)后，最后72 ℃延伸7 min。

3.2 優(yōu)化體系對樣本的擴增結果

運用優(yōu)化好的體系對8批蒙古黃芪樣本進行ISSR-PCR擴增，圖8為部分引物在優(yōu)化好的體系下的擴增結果。由此可以看出本實驗建立的黃芪ISSR-PCR體系穩(wěn)定，可靠。

圖8 部分引物的ISSR-PCR擴增結果圖Fig.8 ISSR-PCR amplification results of some primers

圖9 引物UBC825對8批蒙古黃芪ISSR-RCR擴增結果圖Fig.9 Amplification results of primers UBC825 on 8 batches of A.membranaceus ISSR-RCR

3.3 引物篩選擴增結果

將瓊脂糖凝膠電泳圖導入ZF-258全自動凝膠成像分析系統，對其進行數據統計，記錄擴增條帶的多態(tài)性。根據DNA條帶的有無進行區(qū)分標記，對條帶清晰的記為“1”，對缺失或模糊不清的標記為“0”，對數據進行統計得到01矩陣。將統計結果01矩陣按照POPGENE 1.32 軟件的格式要求修改，導入數據，進行多態(tài)性條帶百分率計算，以及遺傳一致性與遺傳距離分析。結果如表2。篩選的14條引物對8批蒙古黃芪樣本進行擴增，共擴增出126條帶，其中多態(tài)性條數118條，多態(tài)性位點百分數為93.65%，平均每個引物擴出8.43個DNA片段，其多態(tài)性為93.6%，說明黃芪遺傳多樣性豐富。

3.4 遺傳相似系數與聚類結果分析

分別用14條引物對8批蒙古黃芪樣本進行擴增，擴增結果用軟件POPGENE version 1.32采用Nei的標準計算方法(Nei，1978)計算遺傳一致度I與遺傳距離D，所得結果見表3。遺傳一致度I與遺傳距離D均是對樣品間遺傳分化程度的描述。由表3可以看出，8批黃芪樣品的遺傳一致度在0.492 1～0.730 2之間，遺傳距離在0.314 5～0.709 1之間，說明黃芪樣品的遺傳分化程度較大。其中，2號內蒙古南洼村與6號山西五寨丘陵坡地樣品的親緣關系最近，遺傳一致度為0.730 2，遺傳距離為0.314 5；1號內蒙古興和縣與4號山西渾源樣品的親緣關系最遠，遺傳一致度均為0.492 1，遺傳距離均為0.709 1。山西不同產地的遺傳距離變幅為0.347 6～0.559 6，差異比較明顯。

表2 黃芪ISSR擴增反應的引物及擴增的條帶數Table 2 Primers and amplified bands of ISSR amplification reaction

注：B=(T，C，G)； H=(A，T，C)； R=(A，G)； Y=(C，T)； V=(A，C，T)；D=(A，G，T)。

表3 8批黃芪樣品的遺傳一致度與遺傳距離Table 3 Genetic consistency and genetic distance of 8 samples of A.membranaceus

3.5 8批蒙古黃芪樣品的多態(tài)性條帶聚類分析

利用NTSYS-pc 2.1軟件，通過非加權類平均法(unweighted pair-group method arithmetic averages，UPGMA)，對8批蒙古黃芪樣品的多態(tài)性條帶進行聚類分析，并構建樹狀聚類圖(見圖10)。由圖可知，當匹配系數為0.50時，黃芪樣品明顯分為三類。其中，1號內蒙古興和縣跟8號山西渾源官兒鄉(xiāng)樣品分別單獨聚為一類，2號內蒙古南洼村、6號山西五寨丘陵坡地、3號、4號山西渾源、5號山西五寨蘆芽山、7號山西五寨聚為一類。2號內蒙古南洼村與6號山西五寨丘陵坡地樣品間的遺傳距離最近，二者親緣關系最近。而1號內蒙古興和縣與8號山西渾源官兒鄉(xiāng)的距離最遠，說明二者親緣關系較遠。通過比較發(fā)現，UPGMA聚類結果與遺傳一致度與遺傳距離的分析結果(表3)基本是一致的。

圖10 8批蒙古黃芪樣品的UPGMA聚類圖Fig.10 UPGMA clustering map of 8 samples of A.membranaceus

4 討論

本研究采用單因素實驗對影響蒙古黃芪的ISSR反應體系的因素進行了優(yōu)化，并對山西與內蒙古2個產地蒙古黃芪的遺傳多樣性進行了分析。而目前，植物基因多態(tài)性的研究多采用DNA分子標記，DNA間的差異可以通過分子標記呈現。DNA分子標記技術有多種，其中ISSR技術具有操作簡單、多態(tài)性和重復性好等特點，但是ISSR反應受到PCR反應中各因素的影響，不同的樣本需要建立不同的ISSR反應體系[18]。因此，本研究對影響ISSR-PCR反應的dNTPs、引物、MgCl2、Taq酶、DNA、退火溫度進行了優(yōu)化。其中dNTPs、MgCl2、Taq酶、引物濃度對ISSR-PCR擴增影響較大，另外，退火溫度會影響模板與引物的結合，退火溫度低容易發(fā)生錯配，所以適當提高退火溫度會降低錯配率，但太高又會影響復性，所以選擇合適的退火溫度是必要的。

通過對蒙古黃芪的聚類分析發(fā)現，雖然1號和2號蒙古黃芪樣本均來自內蒙古興和縣，且二者地理位置較近，但在聚類圖上卻分為了2大類，這可能與它們生長的小環(huán)境有較大差異有關，使得它們逐漸適應了當地的氣溫、海拔高度、降水等，這與Wang等[19]對長白山地區(qū)安圖與和龍的聚類分析是相似的。2號內蒙古南洼村與山西產地的3-7號蒙古黃芪樣本雖然地理位置較遠，但是聚為了一類，可能是產地之間相互引種造成了基因交流，使得遺傳背景一致，這與Zhang[20]對不同產地蒙古黃芪聚類分析一致。聚類分析中2號內蒙古南洼村野生品、6號山西五寨丘陵地半野生品與4號山西渾源野生品先聚在了一起，而后與山西其他產地栽培品聚為一類，這說明栽培品與野生品之間存在較高的遺傳相似度，體現出它們親緣關系更為接近，這可能與它們生長氣候、降水、光照等有關，這與Zhang[12]對6個蒙古黃芪居群的聚類結果“先以生存方式野生、栽培聚類”分析一致；如果后續(xù)實驗能對不同生長方式蒙古黃芪的化學成分含量進行分析和生長物候條件對蒙古黃芪的影響，以及建立化學成分與分子標記間的聯系，這將對蒙古黃芪種植資源的挖掘與保護提供幫助。

本實驗僅對山西與內蒙古的8批蒙古黃芪進行了遺傳多樣性分析，后續(xù)會采用本實驗建立的ISSR-PCR體系對大規(guī)模不同產地蒙古黃芪進行進一步驗證，收集更多數據，同時結合樣本表型數據對蒙古黃芪進行種質評價；其次，對本次收集樣本進行化學成分含量測定，將此次的PCR結果與黃芪化學成分含量建立聯系，為蒙古黃芪的種質復壯及挖掘品種潛力提供幫助。