大鯢油的水酶法提取及精制過程中脂肪酸組成的變化

李 招，王建文，王建輝 *，王發祥，李向紅，劉永樂，寧靜恒，高慧峰

1長沙理工大學化學與食品工程學院，長沙 410114；2張家界金鯢生物工程股份有限公司, 湖南 張家界 427000

中國大鯢(Andriasdavidianus)，隸屬兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，又名“娃娃魚”。大鯢具有“水中活人參”的美譽，且氨基酸及蛋白質組成與人體所需模式符合程度較高。目前，國內外對大鯢的研究主要集中于人工繁殖、養殖、資源狀況等方面[1]，對其資源綜合利用研究甚少。Li等[2]發現大鯢油脂中富含多種不飽和脂肪酸(UFA)，且UFA對抗衰老[3]、治療心律不齊[4]、動脈粥樣硬化[5]、燙傷、燒傷等作用顯著[6]，潛在利用價值較高。Luo等[7]通過氣相色譜法確定出精制大鯢油中含有25種脂肪酸，Liu等[8]通過氣相色譜-質譜法發現了草魚肌肉中UFA含量較高，且MUFA和PUFA含量豐富。由此可知，大鯢油及草魚油均具有豐富的脂肪酸，但至今對兩者尚無系統比較研究。

水酶法提油是一種綠色健康的油脂提取技術，其具有操作簡單，條件溫和等優點。該法使用蛋白酶借助其良好的破乳效果，能促使與脂質相關的蛋白裂解，促進油滴的聚結和絮凝[9]，在油脂工業中具有較廣的應用前景[10]。Li等[11]以提油率為評價指標，分別利用五種蛋白酶提取三文魚魚皮油，試驗結果表明木瓜蛋白酶提油率最佳。故本實驗采用工藝條件溫和的水酶法，采用木瓜蛋白酶提取大鯢油，通過正交試驗確定水酶法的最優工藝，并比較研究大鯢油精制過程中脂肪酸的組成變化及其與精制草魚油的差異，以期為大鯢油的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大鯢尾部組織由張家界金鯢生物工程股份有限公司提供，均是取自人工飼養大鯢，共3尾，體重為1.8～2.9 kg/尾；草魚，市購，2.0 ± 0.5 kg/尾；木瓜蛋白酶(來源番木瓜)：酶活為800 U/mg，Kayon酶制劑公司。

1.2 主要儀器設備

DS-1高速組織搗碎機，上海圣科儀器設備有限公司；PHS-3C型pH計，上海雷磁儀器廠；LG10-2.4A型高速離心機，北京京立離心機有限公司； YRE-2000B型旋轉蒸發儀，鞏義市予華儀器有限責任；Scion TQ GC-MS，美國布魯克道爾頓公司，DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大鯢尾部脂肪組織粗脂肪含量的測定

粗脂肪含量測定：索氏提取法，參照GB/T5009.6-016。

1.3.2 大鯢油與草魚油的提取

(1)大鯢油提取參考Bai等[12]方法，并稍作修改。具體方法如下：

將大鯢尾部組織清洗、絞碎，按料液比1∶10加入蒸餾水、勻漿、調節pH、加入一定酶，在適當的溫度下酶解一定時間，滅酶，冷卻、離心，分離，提取稱重Q2，計算提取率W(W=Q2/Q1×100%，Q1為原料中大鯢粗脂肪的質量)。

(2)草魚油提取工藝：參考Wang等[13]試驗方法。

1.3.3 單因素試驗

酶解pH：在物料比為1∶10，酶添加量0.75%，酶解溫度55 ℃，酶解時間90 min的條件下，考察不同pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、 8.0)對粗大鯢油提取率的影響。

酶解溫度：在物料比為1∶10，酶添加量0.75%，pH6.5，酶解時間90 min，考察不同溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)對粗大鯢油提取率的影響。

酶添加量：在物料比為1∶10，pH6.5，酶解溫度55 ℃，酶解時間90 min，考察不同酶添加量(0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25%)對粗大鯢油提取率的影響。

酶解時間：在物料比為1∶10，酶解溫度55 ℃，pH6.5，酶添加量0.75%，考察不同酶解時間(30、60、90、120、150、180 min)對粗大鯢油提取率的影響。

1.3.4 正交試驗

在單因素實驗的基礎上，選擇酶解溫度、pH、酶添加量、酶解時間4個因素，采用L9(34)正交試驗設計，以大鯢油提取率為指標，確定大鯢油提取的最佳工藝條件。

1.3.5 粗大鯢油理化指標的測定

酸值：熱乙醇測定法，參照GB/5009.229-2016；

過氧化值：硫代硫酸鈉滴定法，參照GB/T5009.227-2016；

碘值：硫代硫酸鈉滴定法，參照GB/T5532-2008；

水分及揮發物含量：直接干燥法，參照GB/T5009.236-2016；

不溶性雜質：坩堝式過濾器法，參照GB/T15688-2008。

1.3.6 粗大鯢油/草魚油的精制

參考Luo等[7]試驗方法，并稍作修改，具體方法如下：

1.3.6.1 脫膠：稱取一定量的粗大鯢油/草魚油于錐形瓶中，在水浴中將油加熱攪拌至70 ℃，然后按油量的1%緩慢加入濃度為40%的磷酸，70 ℃下均勻攪拌1 min，再以5 000 rpm離心25 min，分離出上層油樣即為脫膠油。

1.3.6.2 脫酸：稱取一定量的脫膠油，再按油量的0.07%加入濃度為200 g/L的氫氧化鈉溶液，在水浴中加熱攪拌至65 ℃，30 min后以5 000 rpm離心15 min，分離上層油樣后再加入1 mL熱的去離子水，洗去殘留皂，反復3次，5 000 rpm離心15 min，分離上層油樣即得脫酸油。

1.3.6.3 脫臭：在55 ℃水浴中，利用旋轉蒸發儀對大鯢油/草魚油旋蒸10 min，即得脫臭油。

1.3.7 GC-MS 檢測

1.3.7.1 甲酯化條件

大鯢油：取油樣0.6 mL于離心試管中，加入5 mL正己烷，搖勻，再加入 2 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液0.25 mL，充分振搖30 s，放入離心機內離心1 min后，取上層液體，進行GC-MS色譜脂肪酸成分含量測定。

草魚油：參考Wang等[13]試驗方法。

1.3.7.2 GC-MS測定條件

色譜柱：Rxi-5ms 毛細管柱(30 m×0.25 μm×0.25 mm)；柱初溫：50 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至160 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，以2 ℃/min升至260 ℃，保持10 min，以5 ℃/min升至300 ℃，保持10 min；進樣口溫度：280 ℃，載氣(He)流量：1.0 mL/min，采用分流模式進行，分流比為5∶1。離子源溫度(EI)：200 ℃，接口溫度：200 ℃，掃描質量數范圍：22.00～500.00 u；進樣量：1 μL。

1.3.8 脂肪酸營養價值評價

大鯢油脂肪酸以及草魚油脂肪酸致動脈粥樣硬化指數(atherogenicindex，AI)和血栓形成指數(thrombogenic index，TI)的評價方法參考Zhang[14]的方法。

參考文獻[14]大鯢油脂肪酸以及草魚油脂肪酸致動脈粥樣硬化指(atherogenicine AI)和血檢形成指數(thrombogenic index,TI)，來評價兩種油對人類心血管疾病發生的影響。其中：

2 結果與分析

2.1 粗脂肪含量

經實驗測定，大鯢尾部中粗脂肪含量為78.89%±0.24%，表明大鯢尾部粗脂肪含量較高，故可作為大鯢油提取的良好原料。

2.2 單因素試驗

2.2.1 pH對大鯢油提取率的影響

pH對粗大鯢油提取率的影響如圖2所示。隨著pH增大，大鯢油提取率先升高后下降，pH在5.5～6.5時，提取率隨著pH增大而增大，當pH為6.5時達86.69%；pH在6.5～8.0時提取率不斷下降。木瓜蛋白酶pH為6～7，隨著pH增大，會影響酶活性中心的構象，從而改變木瓜蛋白酶離子基團的離解狀態，阻礙酶解反應的進行，導致提取率下降[15]。

圖1 pH對大鯢油提取率的影響Fig.1 Effect of different enzyme pH on extraction yield of Andrias davidianus oil 注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。Note:Different letters means significant difference (P<0.05),the same below.

2.2.2 酶解溫度對提取率的影響

溫度對粗大鯢油提取率的影響如圖2所示。隨著酶解溫度增大，大鯢油的提取率呈先上升后下降的趨勢。當溫度在44～55 ℃時，提取率隨溫度升高不斷增大，達86.83%，而隨酶解溫度進一步上升，提取率呈下降趨勢。究其原因可能是隨初始溫度升高酶解反應趨完全，但溫度過高，會改變酶蛋白的結構，引起酶的失活，從而降低酶解效率，使提取率下降[16]。

圖2 酶解溫度對大鯢油提取率的影響Fig.2 Effect of different enzyme temperatures on extraction yield of Andrias davidianus oil

2.2.3 酶添加量對提取率的影響

酶添加量對粗大鯢油提取率影響如圖3所示。大鯢油提取率隨著酶添加量的增加不斷升高后趨于平穩。當酶添加量為0.75%時，提取率為85.56%，與未添加酶組相比(20.03%)，增加了65%；當加酶量為1.00%時，提取率為85.93%，增長較為緩慢，酶添加量為1.25%時，提取率為84.20%。這是因為在底物未達到飽和時，酶量增加可促進蛋白質水解，提取率不斷增大，當達到飽和后，由于酶自身的水解或者抑制作用，酶解程度降低[17]，另外，過量的酶會與底物結合形成絡合物對酶形成了反饋抑制，造成反應速率下降。

圖3 不同酶添加量對大鯢油提取率的影響Fig.3 Effect of different enzyme dosages on extraction yield of Andrias davidianus oil

2.2.4 酶解時間對提取率的影響

酶解時間對粗大鯢油提取率的影響如圖4所示。大鯢油的提取率隨酶解時間的增加先升高后下降。酶解時間在30～120 min時，提取率隨著時間的延長而增大，在120 min時，達86.69%；酶解時間在120～180 min時提取率不斷下降。究其原因，隨酶解時間的延長酶與底物間的反應越充分，從而釋放出脂肪分子。隨著酶解時間進一步延長，由于大鯢油中不飽和脂肪酸發生氧化，不利于營養物質的保持[18]。

圖4 酶解時間對大鯢油提取率的影響Fig.4 Effects of enzyme time on extraction yield of Andrias davidianus oil

2.3 正交試驗

從表1可知，C(酶添加量)、A(酶解溫度)、D(酶解時間)、B(pH)對大鯢油提取率的影響依次減小，正交試驗的最佳組合為A3B2C1D1，即酶解溫度60 ℃，pH 6.5，酶添加量0.75%，酶解時間90 min。

表1 正交試驗設計及結果Table 1 Design and results of orthogonal test

2.4 優化反應條件的結果驗證

按以上優化的提取條件(溫度60 ℃，pH6.5，酶添加量0.75%，酶解時間90 min)進行三組平行試驗驗證，大鯢油提取率為89.34%±1.00%，表明試驗優化的工藝條件可行。

2.5 大鯢油理化特性

所得粗大鯢油的感官指標及理化指標結果如表2所示，符合水產行業標準SC/T3502-2016所規定的粗魚油二級標準。

表2 粗大鯢的油的感官與理化指標Table 2 Sensory and physichemical indices of crude Andrias davidianus oil

2.6 脂肪酸組成分析

2.6.1 粗大鯢油精制過程中的脂肪酸組成分析

粗大鯢油在精制(脫膠、脫酸、脫臭)過程中脂肪酸組成及其相對含量變化如表3所示。粗大鯢油與精制過程中大鯢油脂肪酸組成基本相似，由此表明各項精制工藝對大鯢油脂肪酸組成影響較小。精制大鯢油中SFA含量為23.14%，以C16∶0為主(14.06%)；MUFA含量為37.98%，以C18∶1(油酸)為主(30.52%)；PUFA含量為36.78%，以C18∶2(亞油酸)為主(21.34%)，其中EPA和DHA含量分別達3.57%和4.76%。

精制大鯢油中UFA 含量(74.76%)比草魚油(61.08%)多13.68%， PUFA 含量(36.78%)比草魚油(25.29%)多11.49%。精制大鯢油中 PUFAω-6型含量(24.37%)為草魚油(18.88%)的1.3倍，且ω-6∶ω-3為1.96∶1，與美國專家推薦值2.3∶1接近[19]。精制大鯢油中AI(0.41)和TI(0.33)比草魚油中AI(0.81)和TI(0.61)低，表明前者具有更高的脂肪酸不飽和度，能有效的抑制冠心病和血栓的形成[20]。此外，對人體極為重要的油酸及亞油酸，精制大鯢油中的含量明顯高于草魚油。由此可知，精制大鯢油的保健功能較草魚油更為突出。

表3 粗大鯢油精制過程中脂肪酸組成變化及其與草魚油組成間的差異Table 3 Composition changes of fatty acid in crude Andrias davidianusoil during refining process and their difference with grass carp oil

續表3(Continued Tab.3)

脂肪酸Fatty acid系統名稱Systematic name含量Content(%)粗大鯢油Coarse oilof giant salamander脫膠Degum-ming脫酸Deacid-ification脫臭Deodor-izing草魚油Grasscarp oilC20∶0二十碳酸/花生酸Eicosanoic acid0.090.190.220.210.89總計Sum23.2223.2623.1323.1435.70單不飽和脂肪MUFAC11∶110-十一碳烯酸10-Henedecenoic acid0.090.180.270.250.97C16∶1順-9-十六碳烯酸Cis-9-hexadecenoic acid4.534.724.914.932.28C18∶1順-9-十八碳烯酸/油酸Oleic acid30.1130.3630.5130.5227.28C18∶1順-11-十八碳烯酸11-Octadecenoic acid1.381.241.071.031.78C20∶1二十碳烯酸Eicosenoic acid1.381.221.091.111.89C22∶1順-13-二十二碳烯酸Cis-13-docosenoic aid0.560.320.120.141.59總計Sum38.0538.0437.9737.9835.79多不飽和脂肪酸PUFAC18∶2ω-6亞油酸linoleic acid21.0121.1821.3121.3416.97C18∶3ω-3亞麻酸α-Linolenic acid3.463.693.813.831.93C20∶3ω-6順-8,11,14-二十碳三烯酸Cis-8,11,14-eicosatrienoic- acid0.640.580.300.210.79C20∶4ω-6花生四烯酸Arachidonic acid2.442.692.822.821.12C20∶4ω-3順-8,11,14,17-二十碳四烯酸Cis-8,11,14,17-eicosatetrae-noic acid0.650.310.270.250.98C20∶5ω-3順-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(EPA)Cis-5,8,11,14,17-eicosapent-aenoic aid3.113.333.563.571.98C22∶6ω-3順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)Cis-4,7,10,13,16,19-docosa-hexaenoic aid4.524.644.774.761.52總計 Sum35.8336.4236.8436.7825.29UFA73.8874.4674.8174.7661.08其它脂肪酸/Other fatty acids2.902.282.062.103.22UFA/SFA3.18∶13.20∶13.23∶13.23∶11.71∶1∑ω-6 PUFA24.0924.4524.4324.3718.88∑ω-3 PUFA11.7411.9712.4112.416.41∑ω-6/∑ω-32.052.041.971.962.95

3 結論

本研究采用水酶法優化了大鯢油提取的最佳工藝：酶解溫度60 ℃，pH6.5，酶添加量0.75%，時間90 min，在此條件下大鯢油的提取率達89.34%±1.00%。粗制大鯢油達到SC/T3502-2016粗魚油二級標準。粗大鯢油精制過程中，脂肪酸組成變化較小，精制后的大鯢油中UFA和必須脂肪酸(EFA)相對含量分別達74.76%和25.17%，均高于精制草魚油。本研究確定了水酶法提取大鯢油的最佳工藝條件，初步掌握了大鯢油脂肪酸組成，為大鯢油的開發利用提供了理論依據。然而，對大鯢油中各MUFA和PUFA的定量分析及其分離提取有待開展進一步研究。