黃葵素抑制巨噬細胞浸潤和活化改善db/db小鼠腎纖維化實驗研究

浦 強，徐巍龍，李 楠，王麗娟，余江毅*

1南京中醫藥大學附屬醫院，南京 210029；2如皋市中醫院，如皋 226500

糖尿病是一種慢性代謝紊亂疾病，近年來其發病率迅速增加[1]。糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病最常見的微血管并發癥之一。DKD不僅是慢性腎病和終末期腎病的主要原因，也是心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的主要原因[2]，嚴重威脅著人類健康，給人類造成沉重的社會和經濟負擔。目前糖尿病腎病的主要治療措施包括控制血糖、血壓，調節脂代謝，抗氧化，腎素-血管緊張素系統抑制劑應用等，但療效不理想[3]。因此，積極尋找更加有效的糖尿病腎病防治措施具有重要的實際意義。

糖尿病腎病是以炎性細胞浸潤和促炎因子過表達為特征的慢性炎性疾病[4]。巨噬細胞是關鍵的炎癥細胞，在糖尿病腎病的發展和進展中起著重要作用[5]。巨噬細胞浸潤腎小球和小管間質是絕大多數腎損傷的主要病理特征。過度浸潤的巨噬細胞被腎環境中異常升高的致病因子激活，例如高糖，糖基化終產物(AGEs)和腎素激活后，巨噬細胞激活后可以分泌炎性細胞因子和趨化因子如腫瘤壞死因子TNF-α、白細胞介素IL-1β、單核細胞趨化蛋白MCP-1等，導致腎小球內細胞和基底膜損傷，引起間質纖維化[6]。研究發現去除腎臟募集的巨噬細胞可以有效地減少腎損傷的過程[7]。因此，阻斷巨噬細胞活化途徑，干預糖尿病腎病慢性炎癥，延緩腎纖維化可能是預防和治療糖尿病腎病腎損傷的有效策略。

本課題組臨床實踐發現，中藥黃蜀葵花及制劑應用于糖尿病腎病、急慢性腎炎、腎病綜合征等疾病的治療，具有良好降低尿蛋白，改善腎損傷的臨床療效。藥理研究表明，黃蜀葵花制劑可通過下調腎組織p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK)信號通路，減少腎組織內轉化生長因子TGF-β1的表達及炎癥細胞的浸潤，減輕阿霉素腎病腎組織的炎性損傷[8]；并可以抑制Nod樣受體蛋白(NLRP3)炎癥小體活化和Toll樣受體4/核轉錄因子信號通路[9]；或抑制蛋白激酶B (protein kinase B，Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR/核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase，P70S6K)信號通路[10]，減少腎組織中TGF-β1的蛋白質表達，緩解糖尿病腎病大鼠模型腎臟炎癥損傷。這些都表明，黃蜀葵花具有明確的抗炎，腎保護作用。但黃蜀葵花對糖尿病腎病背景下腎臟巨噬細胞浸潤及活化狀態研究尚少。

黃葵素(total flavones ofAbelmoschusmanihot，TFA)是由黃蜀葵花醇提獲得，主要成分為黃蜀葵花總黃酮，本課題組前期研究發現黃葵素具有抗炎、抗纖維化、抗氧化的腎保護作用，降低尿蛋白，延緩糖尿病腎病的病情進展[11,12]。鑒于此，本研究以db/db小鼠為研究對象，觀察不同給藥劑量黃葵素對db/db小鼠腎組織巨噬細胞浸潤、活化及腎臟炎癥、纖維化的影響作用，從而闡明黃葵素對腎臟保護作用的可能機制，為臨床防治DKD提供新依據。

1 材料和方法

1.1 動物

4周齡SPF級db /db雄性小鼠(BKS.CGm+/+LeprdbNJU)20只，同背景的db/m小鼠5只，體重約20 g，購自南京大學-南京生物醫藥研究所，動物許可證號:SCXK(蘇)2015-0001。所有實驗動物喂養程序嚴格按照南京中醫藥大學制定的實驗動物保護條例執行。

1.2 藥物

黃葵素由江蘇省中醫院制劑部提供，黃葵素溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制成混懸液。

1.3 主要試劑

蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、膠原纖維染色(Masson)染色試劑盒、免疫組化試劑盒(南京建成科技有限公司)；Trizol(日本Takara公司)；逆轉錄試劑盒、SYBR-Green PCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(南京碧云天生物技術有限公司)；ECL檢測試劑盒(南京凱基生物技術有限公司)；波形蛋白(Vimentin)抗體、膠原蛋白III(Collagen III，Col III)抗體(北京四正柏生物科技有限公司)；F4/80抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)、β-actin抗體(美國cell signaling technology公司)；辣根過氧化物酶HRP標記驢抗兔IgG(北京博奧森生物技術有限公司)。

1.4 主要儀器

SONO PULS超聲細胞破碎機(德國Bandelin公司)；Applied Biosystems 7500實時定量RT-PCR儀(美國ABI公司)；激光共聚焦顯微系統TCS SP5(德國Leica公司)；倒置式生物顯微鏡CKX31(日本Olympus公司)；超靈敏化學發光成像儀LAS4000(美國GE公司)；小型蛋白電泳轉移系統(美國Bio-Rad公司)；蛋白轉印槽Mini-protean Tetra Cell(美國Bio-Rad公司)；冷凍型臺式大容量高速離心機5810R(德國Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 動物造模與分組

按隨機數字表法將20只db/db小鼠按實驗分為模型組、黃葵素低劑量治療組(97.5 mg/kg/d，TFA-L)、黃葵素中劑量治療組(195 mg/kg/d，TFA-M)、黃葵素高劑量治療組(390 mg/kg/d，TFA-H)，每組各5只，以同背景的db/m小鼠5只為空白對照組。

2.2 給藥方法及處理

第8周db/db小鼠血糖、尿蛋白明顯升高視為造模成功，db/db小鼠黃葵素治療組按低、中、高劑量(97.5、195、390 mg/kg/d)黃葵素混懸液灌胃，db/m空白對照組與模型組小鼠給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，1次/天，連續16周。于第24周處死小鼠，收集血及腎組織。

2.3 指標檢測

2.3.1 血、尿檢測

第8、12、16、20、24周留取尿液；第24周摘眼取血。血、尿標本統一送江蘇省中醫院檢驗科用全自動生化分析儀檢測尿微量白蛋白/肌酐比值(albumin-creatinine ratio，ACR)及血肌酐，血尿素氮等。

2.3.2 腎臟組織HE、Masson染色

腎組織蠟塊連續切片(3 μm)，經脫蠟、梯度乙醇脫水和HE染色，最后中性樹膠封片。按各試劑盒說明書要求，進行HE、Masson染色，顯微鏡下400倍視野觀察腎組織病理改變。

2.3.3 腎組織免疫組織化學標本留取及巨噬細胞標記F4/80的表達檢測

腎組織蠟塊連續切片(3 μm)采用二甲苯常規脫蠟、入水，3%過氧化氫封閉15 min，10%BSA封閉37 ℃ 孵育30 min。一抗孵育4 ℃過夜，PBS洗后二抗孵育37 ℃，1 h，DAB顯色，水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察腎臟組織病理改變。細胞內或胞膜出現黃褐色為陽性表達。最后分析各組切片的平均光密度(Mean of IOD)值(Image-Pro Plus 6.0軟件分析)。

2.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈技術(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)法檢測腎組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表達

根據Total RNA提取試劑、逆轉錄試劑盒、擴增試劑盒說明書要求進行提取組織的總RNA、逆轉錄及在Applied Biosystems 7500進行擴增反應。引物由上海生工生物公司設計合成，以GAPDH基因作為內參，各引物序列號見下表，結果分析采用2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達量。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence list

2.3.5 Western blot法檢測腎組織中巨噬細胞標記F4/80及纖維化指標Collagen III、Vimentin蛋白表達

取腎組織50 mg，按全蛋白提取試劑盒，勻漿腎臟組織提取蛋白。按照BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白濃度用裂解液配平后，加入4x loading buffer，3 min，95 ℃ 蛋白變性3 min。按試劑盒制備分離膠和濃縮膠后，將等量的各樣本20 uL分別上樣、SDS-PAGE電泳、轉膜，根據目的蛋白的位置留取所需PVDF膜，封閉2 h，分別加入兔抗小鼠一抗，4 ℃ 搖床孵育過夜，加入HRP標記的驢抗兔二抗，室溫孵育2 h，ECL化學發光法顯影，實驗獨立重復3次。將結果用Image Lab軟件進行灰度值分析，及計算與內參β-actin的比值(GraphPad Prism8.0.1軟件分析)。

2.4 統計學處理

3 結果

3.1 各組小鼠尿ACR水平

隨著實驗時間推移，與對照組小鼠相比，模型組小鼠尿ACR水平顯著升高(P<0.01)，表明db/db小鼠出現糖尿病腎損傷的癥狀，且尿蛋白排泄隨腎臟損傷進展逐漸增加。與模型組小鼠相比，各劑量黃葵素干預后小鼠尿ACR升高水平總體呈抑制趨勢，低劑量組僅第16周差異存在統計學意義(P<0.05)；中、高劑量組第12、16、20、24周所測得尿ACR水平均有統計學意義(P<0.05)，尤其高劑量組第20周存在顯著差異(P<0.01)。表明黃葵素降蛋白尿水平與黃葵素給藥劑量相關。

表2 各組小鼠尿ACR比較Table 2 Comparison of urine ACR in mice of each

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Note:Compared with control,*P<0.05,**P<0.01;Compared with model,#P<0.05,##P<0.01.

3.2 各組小鼠腎功能改變

實驗結束時，與對照組小鼠相比，模型組小鼠血肌酐、尿素氮水平明顯升高(P<0.01)，提示db/db小鼠腎損傷明顯，腎功能下降。與模型組小鼠相比，黃葵素給藥組小鼠血肌酐、血尿素氮水平總體呈抑制的趨勢，中劑量組血肌酐、高劑量組血尿素氮下降差異具有統計學意義(P<0.05)，且高劑量組血肌酐下降呈顯著差異(P<0.01)。

表3 各組小鼠腎功能比較Table 3 Comparison of renal function in each group of

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Note:Compared with control,*P<0.05,**P<0.01;Compared with model，#P<0.05,##P<0.01.

3.3 各組小鼠腎臟病理改變

HE染色結果顯示，db/m對照組小鼠腎臟組織結構較清晰，腎小管排列較有序，間質無明顯水腫表現；而db/db模型組小鼠腎組織出現腎小球體積擴大，系膜細胞及基質增生，部分腎小管擴張，腎小管上皮細胞空泡變性，但是通過黃葵素給藥治療后，這些病理改變呈劑量依賴性的減輕(圖1)。

Masson染色結果顯示，db/m對照組小鼠腎臟組織結構正常，腎小球基底膜和間質無明顯膠原纖維的沉積，db/db模型組小鼠腎臟組織顯示腎小球基底膜增厚，大量的膠原纖維沉積在腎間質，腎小管排列結構不清晰。而通過黃葵素治療后，膠原纖維沉積呈劑量依賴性減輕(圖2)。

3.4 各組小鼠腎間質纖維化改變

Western Blot法檢測小鼠腎纖維化指標Col III、Vimentin蛋白結果顯示：與對照組小鼠相比，模型組小鼠腎臟Col III、Vimentin蛋白表達顯著增加(P<0.01)；與模型組小鼠相比，黃葵素各劑量干預后，治療組小鼠腎臟Col III、Vimentin蛋白表達均呈不同程度的抑制，且呈劑量依賴，高劑量較中劑量，中劑量較低劑量相比，兩種蛋白減少更明顯；其中與模型組db/db小鼠相比，黃葵素低劑量治療組Vimentin下降差異無統計學意義，其他黃葵素治療組Col III、Vimentin下降呈顯著差異(P<0.01)(圖3)。

圖1 HE染色各組小鼠腎組織病理形態學變化(×400)Fig.1 Pathological changes of renal tissue in mice of HE staining (×400) 注：A～E：db/m對照組、模型組、黃葵素低劑量組、黃葵素中劑量組、黃葵素高劑量組。Note:A～E:Control,Model,TFA-L,TFA-M,TFA-H.

圖2 Masson染色各組小鼠腎組織病理形態學變化(×400)Fig.2 Pathological changes of kidney tissue in each group of Masson staining mice (×400) 注：A～E：db/m對照組、模型組、黃葵素低劑量組、黃葵素中劑量組、黃葵素高劑量組。Note:A～E:Control,Model,TFA-L,TFA-M,TFA-H.

3.5 各組小鼠炎癥介質表達結果

3.5.1 免疫組化檢測巨噬細胞標記F4/80表達

免疫組化表明：對照組小鼠腎組織僅有少量巨噬細胞標記F4/80陽性巨噬細胞浸潤。與對照組小鼠相比，模型組小鼠腎組織可見大量F4/80標記的棕染細胞，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組小鼠相比，黃葵素各劑量組小鼠腎組織F4/80表達呈不同程度下降，且黃葵素中、高劑量治療組差異具有統計學意義(P<0.05)(圖4和表4)。

圖3 蛋白印跡檢測及光密度分析各組小鼠腎組織Vimentin、Col III蛋白的表達 Fig.3 Western blot analysis and optical density analysis of the expression of Vimentin and Col III protein in kidney tissues of mice 注：A～E：db/m對照組、模型組、黃葵素低劑量組、黃葵素中劑量組、黃葵素高劑量組；與對照組比較，*P <0.05,**P <0.01；與模型組比較，#P <0.05，##P <0.01。Note:A～E:Control,Model,TFA-L,TFA-M,TFA-H;Compared with control,*P <0.05,**P <0.01;Compared with model,#P <0.05,##P <0.01.

圖4 各組小鼠腎組織中F4/80免疫組化變化(×200)Fig.4 Immunohistochemical changes of F4/80 in renal tissues of mice (×200)

3.5.2 Western blot法檢測巨噬細胞標記F4/80表達

Western blot結果顯示：與對照組小鼠相比，模型組小鼠腎組織中F4/80蛋白表達明顯增加(P<0.01)；與模型組小鼠相比，黃葵素給藥治療后，F4/80表達均呈不同程度的降低，黃葵素低劑量組差異無統計學意義(P>0.05)，黃葵素中劑量組差異具有統計學意義(P<0.05)，黃葵素高劑量組差異具有顯著差異(P<0.01)。上述結果提示，巨噬細胞浸潤參與了db/db小鼠腎損傷的過程，黃葵素治療可抑制巨噬細胞的浸潤(圖5)。

3.5.3 RT-qPCR法檢測各組小鼠腎組織炎癥因子TNF-α、IL-1β和iNOS的mRNA表達

RT-qPCR結果顯示：與對照組小鼠相比，模型組小鼠TNF-α、IL-1β的mRNA在腎臟表達顯著上調(P<0.01)，黃葵素各治療組糖尿病小鼠TNF-α、IL-1β的表達呈顯著下降(P<0.01)(圖6)，且呈劑量依賴性，表明黃葵素抑制了糖尿病腎組織中炎癥因子的轉錄表達，發揮抗炎作用；iNOS為M1型巨噬細胞活化的標志，與對照組小鼠相比，模型組小鼠iNOS的mRNA在腎臟表達顯著上調(P<0.01)，黃葵素低、中、高劑量治療各組糖尿病小鼠iNOS的表達呈顯著下降(P<0.01)(圖6)，可見iNOS轉錄表達明顯被黃葵素干預抑制，表明黃葵素還可以調控腎組織中浸潤的巨噬細胞向M1型分化的作用，進一步抑制炎癥因子的產生。

4 討論

黃蜀葵花為錦葵科植物黃蜀葵Abelmoschusmanihot(L.)Medic.的干燥花冠，甘寒，歸腎、膀胱經。具有清熱利濕，消腫解毒等功效[13]。在臨床實踐中，我們課題組發現本虛為糖尿病腎病的發病機理，濕熱致瘀為糖尿病腎病腎臟纖維化的主要病機，早期標實以濕熱瘀阻，應立足于清利濕熱，祛瘀扶正為原則，延緩糖尿病腎病的發展進程，防治其發展為ESRD。本課題組前期研究表明，黃蜀葵花具有明確的抗炎，腎保護作用，進一步探索黃蜀葵花作用于炎癥主要效應細胞巨噬細胞的浸潤及極化，對糖尿病小鼠腎纖維化的作用。

表4 小鼠腎組織中F4/80免疫組化平均光密度值Table 4 Mean optical density of F4/80 in renal tissues of

注：A～E：db/m對照組、模型組、黃葵素低劑量組、黃葵素中劑量組、黃葵素高劑量組；與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Note:A～E:Control,Model,TFA-L,TFA-M,TFA-H;Compared with control,*P<0.05,**P<0.01;Compared with model,#P<0.05,##P<0.01.

圖5 蛋白印跡檢測及光密度分析各組小鼠腎組織F4/80蛋白表達Fig.5 Western blot analysis and optical density analysis of mouse tissue F4/80 protein expression in each group 注：A～E：db/m對照組、模型組、黃葵素低劑量組、黃葵素中劑量組、黃葵素高劑量組；與對照組比較，*P <0.05,**P <0.01；與模型組比較，#P <0.05，##P <0.01。Note:A～E:Control,Model,TFA-L,TFA-M,TFA-H;Compared with control,*P <0.05,**P <0.01;Compared with model,#P <0.05,##P <0.01.

C57BLKS/J db /db小鼠是瘦素(Leptin)受體基因缺陷導致的自發型2 型肥胖與糖尿病動物模型，已廣泛應用于各種糖尿病及并發癥相關實驗。研究證實，db/db小鼠在高血糖背景下7～8周時易發生糖尿病腎臟病變，表現為尿白蛋排泄明顯增多，系膜細胞增生，基底膜增厚，足細胞數目及結構改變等腎臟結構損害，并隨血糖進展，腎臟病變不斷進行惡化[14]，這與2型糖尿病患者有類似的腎臟病變，很好的模擬了糖尿病性腎病腎損傷的特征。尿ACR常用于臨床診斷早期腎病的標準。本研究發現，模型組小鼠的尿ACR水平顯著高于對照組，血肌酐及血尿素氮明顯上升，腎臟病理提示：腎小球體積明顯增大，系膜擴張，腎小管擴張，腎小球基底膜增厚，且大量膠原纖維組織沉積于腎小球，腎纖維化指標：Col III和Vimentin蛋白表達明顯上調，這都表明db/db小鼠在糖尿病病程中出現了糖尿病腎病的表現，證明DKD模型成功。黃葵素治療后，小鼠尿ACR水平呈不同程度控制，腎臟病理損害也呈劑量依賴性的減輕，Col III和Vimentin蛋白表達減輕，充分說明黃葵素具有降低尿蛋白，改善腎纖維化，發揮腎保護作用。

圖6 實時定量PCR檢測各組小鼠腎組織TNF-α、IL-1β和iNOS的mRNA表達Fig.6 RT-qPCR detection of mRNA expressions of TNF-α,IL-1β and iNOS in renal tissues of mice 注：A～E：db/m對照組、模型組、黃葵素低劑量組、黃葵素中劑量組、黃葵素高劑量組；與對照組比較，*P <0.05,**P <0.01；與模型組比較，#P <0.05，##P <0.01。Note:A～E:Control,Model,TFA-L,TFA-M,TFA-H;Compared with control,*P <0.05,**P <0.01;Compared with model,#P <0.05,##P <0.01.

炎癥反應是糖尿病腎病中的重要病理過程，是導致腎損傷、纖維化的重要因素。在腎臟損傷的早期，血管內皮細胞損傷，血管通透性增加，巨噬細胞浸潤入腎臟，在沒有有效的干預情況下，浸潤的巨噬細胞可以分泌不同的炎癥因子，趨化因子，促纖維化因子和其他小分子，改變腎臟的局部微環境，破壞正常間質細胞的結構，并激活某些信號如釋放蛋白水解酶，活性氧簇等導致腎小球損傷，結構重塑、硬化，小管萎縮，間質炎癥及纖維化[15]。本研究采用免疫組化法及WB檢測腎組織中巨噬細胞浸潤情況，qPCR定量分析炎癥因子TNF-α、IL-1β的mRNA表達改變。結果提示，與對照組相比，模型組小鼠巨噬細胞標記F4/80表達明顯增加，且炎癥因子TNF-α、IL-1β的mRNA表達顯著增加，說明糖尿病腎病中有巨噬細胞浸潤入腎臟組織，參與了糖尿病腎病的炎癥進程。黃葵素治療后可下調F4/80的表達，及減少腎組織中炎癥因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達，且呈劑量依賴，證實db/db小鼠發生腎損傷時，過度積累F4/80陽性的巨噬細胞，黃葵素干預減少了浸潤巨噬細胞的數量，抑制了炎癥因子表達，發揮抗炎，腎保護的作用。

iNOS可由活化的巨噬細胞產生，是巨噬細胞活化為 M1 的標志產物之一，M1型細胞主要介導腎臟炎癥和纖維化[16]。在損傷的早期階段，M1型巨噬細胞可誘導活性氧的產生，促進NO的合成，并釋放各種炎癥因子，如iNOS、TNF-α和IL-1β，從而導致腎小球受損內在細胞和基底膜，從而引起蛋白尿和腎小球炎癥[17]。本研究中觀察顯示，與對照組小鼠比較，糖尿病小鼠 iNOS 的 mRNA 表達增加明顯，提示糖尿病小鼠腎組織存在巨噬細胞浸潤同時還存在M1型巨噬細胞活化，黃葵素治療抑制了M1型巨噬細胞的活化。可見，黃葵素抑制巨噬細胞浸潤及極化，減少巨噬細胞活化后炎癥因子的釋放，有明確的抗炎，免疫調節作用。

綜上所述，本研究表明糖尿病小鼠合并腎損傷時，腎臟組織巨噬細胞浸潤明顯，巨噬細胞標志蛋白F4/80及炎癥因子TNF-α、IL-1β的mRNA表達水平顯著升高，并與腎臟纖維化Col III蛋白和波形蛋白表達呈正相關；黃葵素治療可以顯著降低db/db小鼠尿ACR，緩解腎臟的病理損害，改善腎纖維化，具有腎臟保護作用，作用機制可能與其抑制巨噬細胞浸潤、減少炎癥因子表達及抑制M1型巨噬細胞極化有關。但巨噬細胞具有可塑性，功能復雜，根據局部微環境刺激的不同，巨噬細胞可活化為致促炎、組織損傷和致抗炎、防御、組織修復等不同功能的亞型。按表面標記不同可分為經典激活的M1型和替代活化的M2a、M2b、M2c型[18]，如：通過暴露于干擾素(IFN)-γ或脂多糖(LPS)誘導為M1型巨噬細胞，釋放細胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α，具有促炎功能[18]。與此相反，M2型巨噬細胞具有抗炎功能和表達精氨酸酶，甘露糖受體和IL-10等[19]。活化的M2型巨噬細胞可以進一步分為三個亞組：由IL-4和/或IL-13誘導為M2a型巨噬細胞，具有組織修復作用；M2b型巨噬細胞由免疫復合物和M2c型巨噬細胞誘導，具有抗炎作用，并被IL-10、TGF-β或糖皮質激素誘導[20]。研究證實，調節巨噬細胞極化后表型可減輕腎臟炎癥反應，改善腎損害[21]。而黃葵素是否進一步通過調節M1/M2巨噬細胞極化狀態改善腎纖維化，發揮腎保護有待進一步深入研究。