CD14啟動子-159位點基因多態性與中國朝鮮族2型糖尿病患者下肢動脈硬化的相關性

金 明，鄭壽煥，金光明

（延邊大學附屬醫院，吉林 延吉 133000）

下肢動脈硬化（Lower limb arteriosclerosis，LLAS）是2型糖尿病（T2DM）最常見的大血管并發癥之一，根據學者研究，T2DM患者發生LLAS并發癥的概率最高可達到46%[1]，糖尿病病程5年、5～10年和10年以上者，LLAS發病率分別是22.6%、23%和66.7%[2]。當患者在臨床中出現諸如雙下肢靜息痛、間歇性跛行、缺血性壞疽等癥狀時，常常表示下肢動脈缺血已經相當嚴重，此時在臨床上治療方法較為有限。尤其是動脈硬化 （AS）和硬化斑塊 （Arteriosclerosis plaques，ASP）形成會引起動脈管腔的狹窄、閉塞，引發下肢缺血缺氧，最終導致下肢壞疽、壞死，這些均為T2DM患者截肢致殘，甚至死亡的最重要原因，嚴重威脅患者的健康。因此，對LLAS進行早期診斷、早期干預極為重要。本課題組經過多年的研究發現[3-5]，CD14啟動子-159位點基因多態性與T2DM患者頸動脈硬化、糖尿病腎病及糖尿病視網膜病變這些大血管及微血管病變存在相關性，但對于其與LLAS的關聯仍有待研究。延邊地區是我國最大的朝鮮族聚集地，而邊疆地區少數民族的健康問題一直是黨和國家關心的問題，因此在本實驗中，我們探討了CD14啟動子-159位點基因多態性在中國延邊地區朝鮮族T2DM患者中的分布情況，探討該位點的基因多態性與朝鮮族T2DM患者發生LLAS的關系，旨在從基因水平上對LLAS的發病進行早期預防、早期治療，達到造福邊疆地區少數民族患者的目的。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象

選取本院住院的朝鮮族T2DM患者268例，其中男153例、女115例，平均年齡（53.60±10.38）歲。以臨床上公認的1999年WHO的T2DM診斷標準作為依據。根據彩色多普勒超聲結果共篩選出AS患者229例，其中無斑塊（ASNP）患者172例，ASP患者57例。

1.1.2 儀器與檢查方法

選擇西門子公司S2000型多功能彩色多普勒超聲診斷儀，選用血管專用淺表探頭，頻率為7.5 MHz。受檢者檢查前l h禁煙酒，檢查前平臥10 min，打開外周血管動脈條件，取樣容積設為5 mm，探頭置于雙下肢表面，沿血管中央縱切探查，超聲波與血流夾角＜60°。仰臥位時掃查股總動脈、股淺動脈，掃查腘動脈時囑患者采用俯臥位，雙下肢伸直，略分開。檢查時注意兩側對比，下肢動脈縱切面圖像應通過二維超聲顯示。測量內-中膜厚度（IMT），以IMT≥1 mm作為AS診斷標準，以IMT≥1.5 mm為ASP形成標準[6]（圖1）。

1.1.3 臨床資料采集

記錄受試者年齡、性別、血壓、病程、體質量指數（BMI）、吸煙、飲酒與否和實驗室檢查數據，包括空腹血糖（FBG）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）等。BMI=體質量（kg）/身高（m）2。

1.2 方法

基因型檢測：提取DNA后進行PCR擴增，選用Promega公司產品，上游引物為：5，-GCCTCTGACAGTTTATGTAATC-3，下游引物為：5，-GTGCCAACAGATGAGGTTCAC-3。之后取PCR擴增產物10μL，用限制性內切酶AvaⅡ酶切（Promega公司）CD14基因-159位點。反應結束后進行電泳，結果用紫外燈拍攝。

1.3 統計學處理

2 結果

根據Hardy-Weinberg平衡定律，CD14啟動子-159位點基因型分布符合遺傳平衡定律，符合等位基因頻率在人群中的分布。

2.1 CD14基因型分析

CD14 PCR擴增產物經酶切后基因型有3種，CC型（497 bp），CT型（497，353，l44 bp），TT型（353，144 bp）（圖2）。測序結果表明該位點存在C-T的基因多態性（圖3）。

2.2 ASNP組和ASP組基因多態性分布的比較

將CD14啟動子-159位點的CC純合子基因頻率與CT雜合子及TT純合子基因比較，發現存在統計學差異（χ2=0.027，P＜0.05）（表1）。

表1 ASNP組和ASP組CD14啟動子-159位點CC和CT+TT基因型分布比較（例）

2.3 一般臨床資料比較

ASP組收縮壓（SBP）顯著高于ASNP組，（165.55±15.71）mmHg vs（154.78±15.18）mmHg（P＜0.05），但在舒張壓（DBP）、年齡、性別、病程、BMI、FBG和血脂方面無統計學意義（P＞0.05）（表2）。

2.4 ASP危險因素的Logistic回歸分析

患者被認為是一個隊列，而ASP被用作一個獨立變量。年齡、性別、病程、吸煙、飲酒、BMI、SBP、DBP、FBG、TC、TG、C242T突變的存在是Logistic回歸的相關變量。表3結果顯示，病程和吸煙是ASP的獨立危險因素，而C等位基因突變是ASP的風險因素，存在C突變的T2DM患者合并ASP風險增高61%（表3）。

3 討論

圖1 AS和ASP彩色多普勒超聲對比圖。圖1a：內膜厚度為1.2 mm（＜1.5mm），診斷為AS，圖1b：內膜厚度為2.1 mm（＞1.5 mm），診斷為ASP。Figure 1.Comparison of AS and ASP in color Doppler ultrasonography.The thickness of the intima-media in the left image is 1.2 mm(＜1.5 mm),diagnosed as AS,the thickness of the intima-media in the right image is 2.1 mm (＞1.5 mm),diagnosed as ASP.

圖2 CD14啟動子-159位點基因型。M：DNA標記物；1，5：CT基因型；2：CC基因型；3，4，6：TT基因型。圖3 CD14啟動子-159位點基因型測序圖。圖3a：CC純合子，箭頭表示突變型；圖3b：TT純合子，箭頭表示突變型。Figure 2.CD14 promoter gene-159 genotype.M：DNA marker;1,5：CT genotype;2：CC genotype;3,4,6：TT genotype.Figure 3.The sequencing map of CD14 promoter gene-159 genotype.Figure 3a：CC homozygous genotype,the arrow indicates a mutant;Figure 3b：TT homozygous genotype,and the arrow indicates a mutant type.

表2 ASNP組和ASP組患者各組間臨床資料比較

表3 ASP危險因素的Logistic回歸分析

T2DM患者主要表現為糖代謝與脂代謝的雙重紊亂，其高血糖和高血脂狀態會刺激血小板在血管內皮聚集，從而導致血液黏滯度增高，因血流動力學改變引起動脈內皮細胞缺血缺氧，最終破壞內皮的血管屏障功能[7]。在彩色多普勒超聲上，主要表現為二維圖像上的動脈IMT彌漫性增厚形成AS，嚴重者形成ASP，當斑塊堵塞30%以上管腔時，則會造成管腔狹窄、甚至閉塞。

CD14是革蘭陰性細菌細胞壁成分脂多糖（LPS）的受體，其與LPS特異性結合后，可通過Toll樣受體-4以及MD2蛋白向下游傳遞激活信號，從而啟動單核-巨噬細胞系統（MPS），并釋放多種炎性細胞因子發生一系列反應[8]，加速蛋白質糖化產物的形成并導致其在血管內堆積，引起血管平滑肌細胞的增生和動脈內中膜增厚[9]；其次可引發膠原蛋白Ⅲ過量合成[10]或者直接作用于管壁細胞，血管細胞外基質的大量堆積[11]，引起纖維組織增生及鈣質沉著動脈管壁，使內中膜增厚、血栓形成，最終導致AS及ASP形成[12]。

種族和生活環境的差異被認為與疾病差異性密切相關，朝鮮族飲食習慣中鹽分含量高，男性喜飲酒、吸煙，這些均被認為是造成T2DM的高風險因素。其具體機制為煙草中的氧自由基等物質，會損傷患者的血管內皮，造成血管活性平衡失調，增加患者血管的僵硬度；另外，煙草中某些成分會導致患者的膽固醇代謝紊亂，引起血管壁膽固醇清除下降，膽固醇不斷堆積于動脈壁，加快AS的發展[13]。至于病程與ASP之間存在相關性則更好理解，隨著病程的延長，T2DM患者代謝紊亂日益加重，造成大血管病變是疾病發生發展的自然過程。

隨著基因研究的迅猛發展，越來越多的學者喜歡從遺傳、基因水平解釋疾病易感性的不同。在本研究中我們對延邊地區朝鮮族T2DM患者CD14啟動子-159位點進行了基因型的調查。從結果來看，AS和ASP患者相比較，CD14啟動子-159位點CC純合子基因頻率要明顯高于CT雜合子及TT純合子基因，兩者之間存在顯著差異（P＜0.05）。

根據本研究所示，CD14啟動子-159位點基因多態性與中國朝鮮族T2DM患者并發ASP存在相關性，患者中CC純合子基因是較高的危險因素。因此，通過對高危人群進行基因檢測，可以早期發現并排除隱患，及早進行干預治療，意義重大。而彩色多普勒超聲以其價廉、無創、實時可重復等優點，具有廣泛的應用前景。但有一點需要注意，操作者術水平是影響檢測結果的一個重要因素，因此應提高操作者技術水平，按照標準操作流程進行檢查。