內生真菌誘導子通過MeJA介導油樟細胞揮發油積累的研究

嚴 寬，劉 杰，魏 琴，謝 浩

（1.宜賓學院川茶學院；2.宜賓學院生命科學與食品工程學院，宜賓 644000）

油樟[Cinnamomum longepaniculatum(Gamble)N.Chao]主要分布于四川省，其莖、葉等器官可以煉取大量精油，主要為萜類化合物，包含了1,8-桉葉油素、α-松油醇、γ-松油烯等化學物質。油樟精油具有一定的功效性，包括消炎、殺菌和抗氧化等作用。植物內生真菌誘導子誘導植物的次生代謝是通過特定的信號分子和其相應的信號轉導途徑實現的。隨著對信號分子和信號轉導途徑的深入研究，發現在許多植物體中MeJA都發揮著重要的信號分子作用[1]。在施加外源MeJA時，可以誘導植物產生防御機制，誘發多種次生代謝產物的生成[2]。因此，本實驗通過對內生真菌誘導子促進油樟懸浮細胞產生揮發油合成過程中MeJA作用的研究，來探討內生真菌誘導子與油樟懸浮細胞揮發油合成過程中的MeJA信號的轉導機制，以便在未來關于油樟細胞中次級代謝的調控規律能夠有更深入的了解，從而可以找到提高調控油樟細胞揮發油產量的方法。

1 方法與材料

1.1 材料來源與處理

從宜賓紅巖山油樟基地（位于27°50'N;105°20'E）采集了油樟葉的樣本。內生真菌（Penicillium commune，2J1）從油樟植物中分離出來，將這些真菌培養并保存在PDA培養基內。

1.2 建立油樟細胞懸浮體系

選用生長良好的油樟幼嫩葉片培養愈傷組織后，繼代培養2-3次。之后選取色澤鮮亮、長勢良好，質地疏松的嫩黃色愈傷組織，約2.0g/瓶，25℃，遮光，振蕩培養（120 r·min-1）。每隔7 d繼代一次，連續繼代2-3次[3]。

1.3 內生真菌誘導子的制備

將一株青霉菌屬(Penicilliumsp.)的內生真菌接種到配置好的PDA液體培養基中，在28℃，130r/min的震蕩培養箱中培養7d，之后將2J1的菌體與發酵液進行分離，將內生真菌2J1的菌體破碎成勻漿之后與發酵液混合，進行減壓抽濾，最后在高溫高壓滅菌鍋中121℃滅菌20min，便可得到內生真菌誘導子。采用蒽酮-硫酸法測定誘導子糖含量[4]。

1.4 油樟懸浮細胞揮發油的提取與測定

精確稱取烘干之后的油樟細胞0.3g，加入環己烷冷浸過夜（環己烷與細胞的比例為4：1），隨后進行30min的超聲提取，在5000r/min的超速離心機上離心4min，提取上清液，定容到5mL。用針筒抽取液體，濾膜過濾至上樣瓶中，測定揮發油的含量，用GC-MS分析[5]。1,8-桉葉油素的標準曲線Y=73900X-299200，R2=0.9993。

1.5 油樟懸浮細胞中MeJA含量的測定

油樟懸浮細胞中MeJA含量采用頂空固相微萃取技術測定[14]。標準曲線：y=7676.9x+6234.5 R2=0.9985

1.6 數據軟件及處理

揮發油的產量和實驗處理使用三次重復測量。所有相關數據采用SPSS進行路徑系數分析統計19.0和Excel2007進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 內生真菌誘導子對油樟懸浮細胞MeJA釋放量和揮發油積累的影響

在培養7d的油樟懸浮細胞中加入內生真菌2J1粗誘導子40mg/L，以加入等量的PDA培養基為對照組?？疾?J1誘導子對油樟懸浮細胞內MeJA含量和揮發油積累的影響。經過油樟內生真菌2J1處理后的油樟懸浮細胞，培養至第21d時誘導效果最好，產生的揮發油含量較高；但是誘導的時間過長，油樟懸浮細胞揮發油產量反而有所減少。

2.2 MeJA釋放和揮發油積累與不同油樟內生真菌誘導子濃度的關系

分別向培養了7d的油樟懸浮細胞中加入濃度為0mg/L、20mg/L、40 mg/L、60mg/L、80mg/L的內生真菌2J1粗誘導子，在油樟懸浮細胞分別培養21h和14d后檢測不同濃度誘導子對油樟懸浮細胞產生的MeJA釋放和揮發油的積累的影響。

2.3 MeJA對內生真菌誘導子促進油樟懸浮細胞揮發油合成的影響

為了更好的了解內生真菌2J1粗誘導子通過化學信號MeJA誘導促進油樟懸浮細胞產生揮發油的作用機制，在油樟懸浮細胞培養到7d后進行了如下處理，設置了如下圖中的對照試驗，通過檢測其中各組中油樟懸浮細胞MeJA（圖1）和揮發油的合成情況（圖2）進行分析研究，其中內生真菌2J1粗誘導子、SHAM、外源MeJA的添加濃度分別為40 mg/L、2mmol/L、100μmol/L。檢測油樟懸浮細胞MeJA釋放量的時間為處理后21h，檢測油樟懸浮細胞揮發油的合成時間為處理后14d。

結果表明，添加外源MeJA可以促使油樟細胞中的揮發油合成。而SHAM則可抑制細胞中MeJA的積累，并導致揮發油產量的降低。但是，添加SHAM沒有使內生真菌誘導子誘導的油樟細胞揮發油的合成量削減完全，因此在油樟懸浮細胞中可能存在由MeJA作為信號分子的調控揮發油合成的信號途徑。

3 討論

由于內生真菌誘導子屬于細胞外的物質不能直接進入細胞發揮作用，所以需要依靠植物細胞膜外的特異性受體，當它與細胞膜上受體結合后，便會使細胞的結構發生變化，產生出一些特定的胞內信使物質，這些信使物質可以通過一系列的信號轉導進而實現對特定基因的調控作用，使植物細胞中的防御性次生代謝系得以激活，進而可以使植物次生代謝產物合成增加[6]。因此，MeJA的迸發可能是經2J1粗誘導子處理后出現的前期反應，MeJA可能屬于胞內的一種信使物質，經過一系列復雜的生化反應，成功誘導了油樟細胞中揮發油產量的提升。本研究雖然對MeJA介導內生真菌誘導子對油樟揮發油合成的調控機制做了進一步研究。因此為了能夠使誘導子充分的發揮其誘導作用，關于內生真菌2J1粗誘導子的純度和結構有必要做進一步的純化和檢測，以此來研究誘導子更好的制備和保存方法[7]。由此實驗還可以推測出存在著其他途徑引起油樟細胞中揮發油的合成與積累。植物次生代謝產物的合成途徑是非常復雜的，可能還存在其他的信號轉導途徑，這仍需進一步的研究。

圖1 各組中MeJA的累積情況

圖2 各組中揮發油的累積情況