乳腺癌高表達基因1在前列腺癌組織中的表達及臨床意義

夏 康，郭 佳，翟官忠，劉澤林，王 瀟，劉修恒

(武漢大學人民醫院泌尿外科，湖北武漢 430060)

乳腺癌高表達基因1(breast cancer overexpressed gene 1，BCOX1)是在乳腺癌研究中新發現的腫瘤相關基因[1]。BCOX1被發現以來，研究主要集中在闡明該基因在乳腺癌中的作用。我們發現其所在的人類染色體17q11.2-q22區域中多個突變的基因位點與前列腺癌易感性相關[2]。在本課題組前期的體外實驗中發現，異常表達的BCOX1具有調控前列腺癌細胞增殖、浸潤和轉移的能力[3]。到目前為止，BCOX1在前列腺組織中的表達情況尚不明確。本研究旨在檢測BCOX1在良惡性前列腺組織中的表達水平，分析其與前列腺癌患者臨床病理學特征的相關性，探討BCOX1對前列腺癌患者生存的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標本經武漢大學人民醫院倫理委員會批準后，收集2006年1月至2012年6月在武漢大學人民醫院泌尿外科行前列腺癌根治術的100例患者的手術標本作為實驗組。對照組為80例同期行經尿道前列腺電切術患者的良性前列腺增生組織標本。所有患者均經病理學確診，且在手術前均未經內分泌治療、放療、化療等其他治療干預。回顧性收集以上100例前列腺癌患者的臨床病歷資料：術前血清前列腺特異抗原(prostate specific antigen，PSA)、前列腺癌TNM臨床分期、術后Gleason評分、精囊侵犯、血管侵犯和切緣狀態。

1.2 免疫組化法將實驗組與對照組的前列腺石蠟組織標本，切片(4 μm)后脫蠟、水化。消除內源性過氧化物酶并行抗原修復。一抗為BCOX1兔抗人多克隆抗體(Biorbyt，USA)，4 ℃過夜。滴加二抗后二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，并用蘇木素復染，常規脫水干燥后封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 結果評判在Olympus顯微鏡下觀察，BCOX1陽性染色位于細胞質中，表現為淡黃色細顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆粒。染色評判方法為依據組織中陽性細胞百分比和細胞的染色強度綜合判斷。陽性細胞數<5%為0分；陽性細胞數<50%為1分；陽性細胞數>50%為2分。胞質不染色或微弱染色為0分；胞質染色為1分；胞質強染色為2分。將以上2種評分相加后為BCOX1在前列腺癌組織中的表達水平：0～2分為低表達，3～4分為高表達[4]。由2名經驗豐富的病理科醫師在不知曉樣本的臨床和病理信息情況下，使用以上評分標準進行判定，達成共識。

1.4 對所有前列腺癌患者術后進行門診和電話隨訪生化復發(biochemical recurrence，BCR)：手術后未接受輔助治療的患者，連續2次PSA≥0.2 ng/mL[5]。無生化復發生存期(BCR-free survival，BRFS)：手術之日算起，終止日期為生化復發的時間；總生存期(overall survival，OS)：手術之日算起，終止日期為死亡或末次隨訪日期，按月計算。

1.5 統計學方法應用SPSS 18.0統計軟件分析，分類變量采用χ2檢驗，單因素生存分析采用Kaplan-Meier法并用Log-rank檢驗，用Cox回歸模型分析各變量與預后的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 前列腺癌組織和良性前列腺增生組織中BCOX1蛋白的表達BCOX1主要在前列腺癌組織的細胞質內表達，正常前列腺組織中細胞質無或淺染色，在Gleason評分>7的高度惡性前列腺癌組織中的細胞質深染(圖1C)。將BCOX1在前列腺組織中的蛋白表達水平分為低表達和高表達，進行統計學分析。80例良性前列腺增生組織中BCOX1高表達率為7.50%(6/80)；100例前列腺癌組織中BCOX1高表達率為72.00%(72/100)，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果說明，在蛋白水平BCOX1在前列腺癌組織中的表達水平顯著高于良性前列腺增生組織。

圖1 BCOX1在前列腺良惡性組織中的蛋白表達(免疫組化，×400)

A：良性前列腺增生組織；B：低度惡性前列腺癌組織；C：高度惡性前列腺癌組織。

2.2 BCOX1蛋白表達與前列腺癌臨床病理的關系在前列腺癌組織中，BCOX1蛋白表達水平在不同Gleason評分和PSA水平之間差異具有統計學意義(P<0.05，表1)，而在不同年齡、TNM臨床分期、周圍血管侵犯、術后切緣狀態和精囊侵犯之間差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

2.3 BCOX1的表達與前列腺癌患者的BRFS和OS的關系利用Kaplan-Meier對不同BCOX1表達水平前列腺癌患者的BRFS和OS進行生存曲線分析，結果顯示，BCOX1高表達前列腺癌患者與低表達患者比較5年BRFS明顯縮短，且BCOX1高表達前列腺癌患者5年OS顯著低于低表達前列腺癌患者(P<0.05，圖2)。

2.4 影響前列腺癌患者預后的單因素和多因素生存分析對100例前列腺癌患者生存資料進行預后分析，單因素分析發現TNM臨床分期、精囊侵犯、術后切緣狀態以及BCOX1表達水平與BRFS和OS相關；將上述各因素納入多因素Cox回歸分析發現TNM臨床分期、精囊侵犯、術后切緣狀態以及BCOX1表達水平與BRFS和OS相關(表2，表3)。單因素及多因素Cox回歸分析均提示BCOX1是前列腺癌患者預后的獨立危險因素。

表1 不同Gleason評分、臨床分期、PSA水平、精囊侵犯、血管侵犯和切緣狀態前列腺癌組織中BCOX1蛋白的表達[例(%)]

項目例數BCOX1蛋白低表達高表達χ2值P值年齡(歲)0.6310.427 <604210(23.81)32(76.19) ≥605818(31.03)40(68.97)Gleason評分4.9820.026 <72411(45.83)13(54.17) ≥77617(22.37)59(77.63)TNM臨床分期2.1160.146 16020(33.33)40(66.67) 2或 3408(20.00)32(80.00)周圍血管侵犯0.3450.557 陰性338(24.24)25(75.76) 陽性6720(29.85)47(70.15)PSA(ng/mL)7.4790.006 <104619(41.30)27(58.70) ≥10549(16.67)45(83.33)術后切緣狀態1.7730.183 陰性4315(34.88)28(65.12) 陽性5713(22.81)44(77.19)精囊侵犯2.4800.115 陰性7925(31.65)54(68.35) 陽性213(14.29)18(85.71)

PSA：血清前列腺特異抗原。

圖2 BCOX1高表達與低表達前列腺癌患者的生存曲線

表2 單因素和多因素分析影響前列腺癌患者BRFS的危險因素

變量單因素分析Exp(B)95%CIP值多因素分析Exp(B)95%CIP值年齡(歲)1.7180.952～3.1030.072Gleason評分0.6630.336～1.3100.237TNM臨床分期2.5901.442～4.6500.0012.1011.155～3.8220.015周圍血管侵犯1.8710.966～3.6230.063PSA(ng/mL)0.9890.549～1.7830.971術后切緣狀態3.9412.058～7.5450.0002.9431.461～5.9270.003精囊侵犯3.5501.939～6.4980.0002.0121.042～3.8830.037BCOX13.4031.345～8.6080.0102.5821.019～6.5470.046

PSA：血清前列腺特異抗原；BCOX1：乳腺癌高表達基因1；BRFS：無生化復發生存期。

表3 單因素和多因素分析影響前列腺癌患者OS的危險因素

PSA：血清前列腺特異抗原；BCOX1：乳腺癌高表達基因1。

3 討 論

前列腺癌的生化復發提示預后不良，隨著對前列腺癌研究的不斷深入，前列腺癌預后評估相關新型分子標志物不斷被發現。共濟失調毛細血管擴張突變基因(ataxia telangiectasia mutated gene，ATM)與乳腺癌敏感基因1/2(breast cancer susceptibility gene 1/2，BRcA1/2)的突變能區分惡性程度較高的前列腺癌和惰性前列腺癌；神經纖毛蛋白2(neuropilin 2，NRP 2)可作為高危前列腺癌的獨立危險因素；前列腺癌根治術前中性粒細胞和淋巴細胞比值(neutrophil lymphocyte ratio，NLR) 與患者高生化復發率密切相關[6-8]。基于腫瘤基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫，按照BCOX1基因的表達水平和Gleason評分將前列腺癌患者分組后，利用UALCAN公共網站(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)可進行基因表達與生存分析的在線統計學分析[9]。

BCOX1基因序列是由1 103個堿基對構成，可以編碼由222個氨基酸組成的BCOX1蛋白，在細胞漿內表達[10]。研究表明BCOX1主要在乳腺癌組織中存在，特別是在惡性程度較高的乳腺癌(浸潤性和轉移性乳腺癌)中高表達。最近研究表明BCOX1表達與乳腺癌的病理級別、人類表皮生長因子受體2 (human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2)以及三陰性乳腺癌相關，BCOX1的高表達可以作為預測乳腺癌不良預后的新生物指標[11]。BCOX1基因所在的人類染色體17q11.2-q22區域中部分基因位點突變被認為與前列腺癌易感性相關[12]。通過分析公共microarray數據庫(https://www.oncomine.org/)中的人類前列腺組織中BCOX1的數據，發現BCOX1的mRNA水平在前列腺癌組織中的表達顯著高于良性前列腺增生組織，而BCOX1在前列腺組織中的具體表達情況尚不清楚[13]。

本研究中我們用免疫組化染色方法觀察100例前列腺癌組織和80例良性前列腺增生組織中的BCOX1的表達情況，結果顯示，蛋白水平BCOX1在前列腺癌組織中的表達水平顯著高于良性前列腺增生組織，異常表達的BCOX1可能與前列腺癌具有相關性。進一步分析BCOX1與前列腺癌臨床病理參數的關系，結果發現在前列腺癌組織中，BCOX1蛋白表達水平在不同Gleason評分和PSA水平之間差異具有統計學意義，提示BCOX1高表達可能是前列腺癌的高危因素與術后復發相關。

通過Kaplan-Meier生存分析發現前列腺癌患者中BCOX1的蛋白表達水平與患者術后BRFS和OS相關，進一步利用Cox比例風險回歸模型分析，結果顯示BCOX1的表達是前列腺癌患者術后復發和預后的獨立危險因素，BCOX1表達較高的前列腺癌患者生存期相對較短。本實驗結果與TCGA數據庫有關BCOX1基因與前列腺癌預后的關系具有一致性。BCOX1在前列腺癌中的具體作用機制尚不明確，本課題組前期研究發現異常表達的BCOX1不僅可以調控前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，還可以影響STAT3信號通路的激活參與前列腺癌細胞神經內分泌分化的調控。神經內分泌分化最具有代表性的標記物是嗜鉻粒蛋白A，可以作為去勢抵抗性前列腺癌患者生存期的預測指標[14]。以上結果表明，BCOX1是前列腺癌的相關癌基因，是判斷前列腺癌預后的潛在指標，可能為優化患者的術后臨床決策提供依據，提高患者的生存期。

本研究為單中心回顧性研究，標本量較小，可能導致患者的代表性差，結果存在一定偏倚。此外前列腺癌患者的生存期較長，本研究隨訪時間較短，今后我們將加大樣本量并繼續對這部分患者進行隨訪研究。BCOX1能否作為分子生物學診斷和治療的靶點，有待后期實驗進一步研究。

綜上所述，BCOX1在前列腺癌組織中高表達，其表達水平與前列腺癌術前PSA水平、術后Gleason評分有關，與前列腺癌患者預后密切相關，可為篩選高風險前列腺癌患者提供重要信息，有助于對具有潛在復發風險和不良預后的患者進行早期綜合治療。BCOX1可能成為監測前列腺癌患者預后的理想指標。