大白菜非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術影響因素研究

2019-12-03 06:53:26張紅徐瑩莉黃志銀李梅范偉強王超楠

安徽農業科學 2019年21期

張紅　徐瑩莉　黃志銀　李梅　范偉強　王超楠

摘要電泳技術是分子標記輔助育種技術的關鍵步驟，建立一套高效的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術體系可提高分子標記輔助育種技術的工作效率。以根腫病抗感大白菜作為試材，以凝膠聚合速度及凝膠條帶的清晰度作為衡量標準，分別對電泳中的凝膠濃度、溫度、促凝劑配比3個重要因素進行研究。結果發現凝膠濃度、溫度、促凝劑配比均與凝膠聚合時間呈現負相關，但4種常用凝膠濃度制膠時間差異不明顯，可主要根據目的產物的大小選擇濃度。在凝膠質量方面，溫度、促凝劑配比與凝膠的脆性呈負相關。綜合分析，操作中環境溫度為25～35 ℃，促凝劑配比為1∶10的條件，聚合速度適中，條帶清晰，檢測效果最佳。

關鍵詞非變性聚丙烯凝膠電泳;凝膠濃度;溫度;促凝劑配比;大白菜

中圖分類號 S332.2文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）21-0105-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.031

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research on Influence Factor of Non Denatured PAGE Technology of Chinese Cabbage

ZHANG Hong1，XU Yingli2，HUANG Zhiyin1 et al

（1.Tianjin Kernel Institute of Vegetables，State Key Laboratory of Vegetable Germplasm Innovation，Tianjin Vegetable Genetics and Breeding Enterprise Key Laboratory，Tianjin 300381; 2.Life Science College of Tianjin Normal University，Tianjin 300387）

Abstract The electrophoresis technology is the key step in the molecular marker assisted breeding technology.Establishing a set of effective system of modified polyacrylamide gel electrophoresis technology could improve the working efficiency of the molecular marker assisted breeding technology.Taking Chinese cabbage with resistance to club root as test materials，polymerization time to gel and the definition of the gel strips as standards，the concentrations of the gel temperature and ratio of coagulant were studied.Found that the gel concentration，temperature，ratio of coagulant were negatively correlated with gel time，but the differences of gel time by four kinds of commonly used gel concentration were not obvious，we can choose the concentration mainly according to the size of the objective.In terms of gel quality，the temperature and the ratio of coagulant were negatively correlated with the brittleness of the gel.Therefore，comprehensive analysis showed that the polymerization speed was moderate，the strip was clear，and the detection effect was the best when? the environmental temperature was 25-35 ℃，the ratio of coagulant promoter was 1∶10.

Key words Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis;Gel concentration;Temperature;The ratio of coagulant;Chinese cabbage

基金項目青年科研人員創新研究與實驗項目（2018013，2018003，201913）;天津市現代農業產業技術體系創新團隊建設專項計劃（ITTVRS2017003）。

作者簡介張紅（1990—），女，天津人，研究實習員，碩士，從事大白菜分子育種研究。通信作者，副研究員，從事十字花科蔬菜育種研究。

收稿日期 2019-07-25

隨著分子生物學與信息學的快速發展，分子標記輔助育種技術（marker assisted selection，MAS）應運而生，它彌補了傳統育種周期長、篩選靠經驗等不足，不僅大大縮短了新品種的選育進程，降低了選育過程中的工作量，而且從基因水平上確保了篩選的準確性，該技術已被廣泛應用于水稻[1]、小麥[2]、白菜[3]、辣椒[4]等農作物及經濟作物品種的選育中。分子標記輔助選育過程中關鍵步驟就是對PCR擴增產物的檢測，對于操作者來說，熟練掌握相關檢測技術至關重要。目前實驗室常用的檢測方法主要是瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），瓊脂糖凝膠操作過程更為簡便，初學者較易掌握，但它適用于長度200 bp至近50 kb的DNA，對于小片段DNA的檢測分辨率差;聚丙烯酰胺凝膠電泳則適用于高通量的樣本檢測，對于分離5～500 bp的DNA效果更佳，分辨率更好。黃烈健等[5]認為在進行近等基因系的差異分析時，SSR類型的標記比RAPD標記更具有優勢性。而針對SSR類型的分子標記，采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠高效地檢測出單拷貝的差異，因此該檢測方法在實踐應用中選擇率更高。但它的操作過程相對更為繁瑣，制膠、跑膠、染膠過程影響成敗的因素也復雜，國內對此的相關研究主要集中在染膠方法的改進[6]，對制膠影響因素的關注相對缺乏，初入實驗室的研究者很難自主掌握規律。

中，凝膠質量最佳。

凝膠濃度、操作環境溫度、促凝劑配比等都會影響凝膠聚合速度和凝膠檢測效果。該試驗從凝膠聚合速度和檢測效果出發，綜合研究了3個主要因素[14-15]的作用，發現凝膠濃度對聚合時間的影響較小，但它決定著形成分子篩的孔徑大小，通過影響目的產物的通過，從而影響檢測效果。相比而言，制膠過程中的溫度和促凝劑配比對聚合速度及檢測效果影響明顯，實驗室批量操作，建議選擇25～35 ℃，APS∶TEMED配比1∶10的試驗條件，凝膠聚合時間大約在8 min，不僅能有效縮短制膠時間，而且跑膠讀帶效果清晰。

47卷21期張紅等大白菜非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術影響因素研究

參考文獻

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