Ⅱ型豬鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗

劉運鎮　桂文龍　溫思怡　謝昕芳

摘要 2018年8月，江蘇省蘇中地區某豬場出現疑似感染豬鏈球菌，病理剖檢可見發病豬表現為腦膜、肺臟、腎臟、淋巴結出血腫脹，關節腔有纖維素性滲出物等病理變化，取鼻、肺、腦等組織進行細菌鮮血培養基分離培養24 h可見不同的溶血現象;染色鏡檢可見紫色成對、短鏈或長鏈排列的球菌;生化試驗對乳糖、海藻糖、七葉苷產酸產氣，甘露醇、山梨醇等不反應;經PCR檢測最終確診該豬場為Ⅱ型豬鏈球菌感染。藥敏試驗結果表明，該豬場豬鏈球菌對慶大霉素等常規藥物不敏感，而對頭孢曲松、氨芐西林具有較強的敏感性。

關鍵詞 Ⅱ型鏈球菌;藥敏試驗;分離;鑒定; PCR

中圖分類號 S858.28文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）21-0102-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.030

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Isolation，Identification and Drug Sensitivity Test of Streptococcus suis Type 2

LIU Yunzhen， GUI Wenlong， WEN Siyi et al

（Jiangsu Agrianimal Vocational College， Taizhou，Jiangsu? 225300）

Abstract In August of 2018， a pig farm in central area of Jiangsu Province was suspected to be infected with Streptococcus suis. Pathological examination revealed that the pigs were manifested as following： the meninges， lungs， kidneys and lymph nodes were hemorrhagic and swollen， and there were cellulosic exudates in the articular cavity;the tissues of nose， lung and brain were isolated and cultured on bacterial blood culture medium， and different hemolysis phenomena were observed 24 hours later;the purple， paired， shortchain or longchain cocci were seen by staining microscopy;biochemical experiments showed that it produced acid and gas from lactose， trehalose and aescin. Mannitol and sorbitol did not react;the infection of S.suis type 2 was finally diagnosed by PCR. At the same time， the dug sensitivity test showed that S.suis was not susceptible to routine drugs such as gentamicin， and had strong susceptibility to ceftriaxone and ampicillin.

Key words Streptococcus suis type 2;Drug sensitivity test;Isolation;Identification;PCR

基金項目 江蘇省大學生創新創業訓練計劃項目;常州金牧藥業有限公司產學研合作項目（00010114011）。

作者簡介 劉運鎮（1978—），男，江蘇邳州人，講師，碩士，從事獸醫臨床研究。通信作者，副教授，碩士，從事動物傳染病研究。

收稿日期 2019-05-16;修回日期 2019-05-28

豬鏈球菌病是由致病性豬鏈球菌感染引起的一種人畜共患病[1]。豬鏈球菌是豬的一種常見和重要病原體，發病豬主要表現為腦膜炎、心內膜炎、肺炎、關節炎和敗血癥等癥狀。少部分患者發生鏈球菌中毒性休克綜合征，嚴重病例病情進展非常快，如果診斷、治療不及時，預后較差，病死率極高[2-4] ，對我國養豬業有很大的影響，目前我國抗生素主要用于豬鏈球菌疾病的預防和治療，由于長期使用抗生素，導致耐藥性的產生，使得豬鏈球菌的發病率和死亡率顯著上升。2018年12月，江蘇某豬場發生疑似豬鏈球菌病例。筆者通過細菌分離培養、生化試驗、PCR鑒定確定為Ⅱ型豬鏈球菌感染，通過藥敏試驗確定其耐藥性，為該養殖場及周邊豬場豬鏈球菌病的防控提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集。采用李淼[5]的方法對疑似發病豬分別進行鼻腔拭子和肺臟、腦組織的采集，所有病料采集嚴格按照無菌操作，采集后2 h內送往實驗室進行檢測。

鼻腔拭子采集：對疑似發病豬的鼻孔周圍，用滅菌水進行清洗后，將滅菌過的醫用棉簽插入鼻孔中，旋轉360°后取出，放入滅菌的1.5 mL EP管中（裝有含5%的無菌小牛血清的TSB培養基），封蓋、標記后放于冰盒保存。肺臟采集：用滅菌過的組織剪，從喉頭下端將氣管剪斷，連同肺臟一起取出放于封口袋中，標記后放于冰盒保存。腦組織采集：將疑似發病豬的顱骨切一方形小口，用滅菌過的組織剪將將腦組織輕輕挑出，放于封口袋中，標記后放于冰盒保存[5]。

1.1.2 試劑。 TSB肉湯培養基、小牛血清和藥敏試紙（購自杭州天和生物制品有限公司）、滅菌水（自制）、哥倫比亞綿羊鮮血平板、DNA提取試劑盒、2×ES Taq MasterMix（購于上海晶抗生物工程有限公司）。

1.1.3 引物的設計與合成。

根據GenBank數據庫已發表的SS基因序列，通過比對分析后找出保守序列，使用Primer Premier 5軟件針對保守序列設計引物SS-F和SS-R，并以陽性樣品為模板進行PCR擴增，得到預期大小為415 bp的片段[6]。對分離的豬鏈球菌繼續進行分型檢測，根據設計引物SS1-F、SS1-R、SS2-F、SS2-R、SS7-F、SS7-R、SS9-F、SS9-R進行PCR擴增，獲得預期大小分別為719、524、710、569 bp的片段，見表1。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養。采用李淼[5]的方法對采集的病料進行細菌分離與培養。

鼻腔拭子的細菌分離培養：冰盒保存的鼻腔拭子1.5 mL EP管放于恒溫培養箱37 ℃培養2 h后，用移液槍吸取20 μL培養液滴入哥倫比亞綿羊鮮血平板中，用滅菌接種環涂抹均勻，標記后放于37 ℃恒溫培養箱中培養12 h，然后用接種環挑取具有淺綠色溶血環的疑似豬鏈球菌小菌落，在另外一個哥倫比亞綿羊鮮血平板中劃線、標記后，將平板放于37 ℃恒溫培養箱中純培養24 h[5]。

肺臟和腦組織的細菌分離培養：用組織剪剪取0.5 g左右組織，剪碎后放入勻漿機中勻漿5 min，確保其充分打碎，然后將破碎的的組織用生理鹽水1 000倍稀釋，充分混合均后;用移液槍取20 μL稀釋液滴入哥倫比亞綿羊鮮血平板中，用滅菌接種環涂抹均勻，標記后放于37 ℃恒溫培養箱中培養12 h，然后用接種環挑取具有淺綠色溶血環的疑似豬鏈球菌小菌落，在另外一個哥倫比亞綿羊鮮血平板中劃線、標記后，將平板放于37 ℃恒溫培養箱中純培養24 h[5]。

1.2.2 細菌的染色鏡檢。用滅菌接種環挑取疑似豬鏈球菌純培養物菌落，采用革蘭氏染色法染色，置于高倍顯微鏡下鏡檢，觀察細菌形態。

1.2.3 生化試驗。

將分離培養得到的菌株接種到進行甘露醇、蔗糖、果糖、麥芽糖、甘露糖、七葉苷等生化反應管中，37 ℃條件下培養48 h，觀察生化反應特征。

1.2.4 PCR鑒定。

參照鄒君等[7]建立的多重PCR檢測方法，采用煮沸裂解法制備細菌 DNA 模板。取適量的過夜培養液，以12 000 r/min離心5 min，棄去培養基，用無菌超純水洗滌沉淀2次，并用100 μL超純水重懸細胞。100 ℃金屬水浴鍋作用 10? min，置于冰浴中冷卻10? min，12 000 r/min 離心 10? min，取上清液作為 DNA 模板。PCR反應體系如下：Premix Taq 12.5 μL、正向引物 0.5 μL、反向引物 0.5 μL、cDNA樣品 2 μL，補ddH2O至25 μL。PCR反應程序如下：94 ℃? 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃延伸45 s，40個循環;72 ℃延伸10 min;16 ℃ 1 min。按照瓊脂糖凝膠電泳SOP（編號）對PCR擴增產物進行凝膠電泳，并判斷結果。

1.2.5 藥敏試驗。

按照CLSI M100的標準進行藥物試驗。用滅菌棉簽刮取細菌純培養物，使之溶解于滅菌生理鹽水中，將菌落濃度調整為0.5麥氏單位，取適量菌懸液均勻涂布于MH瓊脂平板上，略干后貼上藥敏紙片，于37 ℃下培養18 h后，測量抑菌環直徑[8]。判定標準如下：抑菌圈直徑 <10 mm為耐藥，抑菌圈直徑 10～15 cm為中度敏感， 直徑>15 mm則為高度敏感。

2 結果與分析

2.1 細菌分離結果

待檢病料經過24 h培養，鼻拭子病料分離到1株可疑菌株，在鮮血培養基上菌落呈針尖大小、圓形隆起，濕潤透明，灰白色，菌落周圍形成完全透明的溶血圈，為β-溶血[9]。

2.2 細菌的染色鏡檢

在革蘭氏染色后，顯微鏡檢查顯示病料培養物為球菌，呈單個、成對，短鏈或長鏈排列，且革蘭氏染色為紫色（陽性），其病料組織觸片鏡檢細菌形成對、短鏈、無鞭毛、無芽胞。

2.3 生化試驗結果

由表2可知，3種病料培養的菌落生化特征均與鏈球菌生化指標相一致。

2.4 PCR鑒定結果

通過瓊脂糖凝膠電泳SOP（編號）對PCR擴增產物進行電泳，擴增到524 bp大小片段，結果如圖1所示。

通過PCR擴增，分離細菌基因檢測結果為陽性，說明該豬場發病豬分離菌株為Ⅱ型豬鏈球菌。結合病理變化和生化試驗結果，可確定該豬場發生Ⅱ型豬鏈球菌病。

注：1.Marker;2.樣品;3.陽性對照（2型鏈球菌，524 bp）;4.陰性對照

Note：1.Marker;2.Sample;3.Positive control （S.suis type 2， 524 bp）;4.Negative control

圖1 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果

Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products

2.5 藥敏試驗結果

由表3可知，該豬場分離出的菌株對較多藥物具有較強的耐藥性，該分離菌株對頭孢曲松、哌拉西林、氨芐西林、呋喃唑酮等藥物高度敏感，而對環丙沙星、紅霉素、慶大霉素、阿莫西林、諾氟沙星等藥物不敏感。經調查發現該豬場在日常生產中經常采用環丙沙星、紅霉素、慶大霉素等藥物進行疾病防控，導致耐藥性的產生。

3 討論

對送檢的病死豬病料，分別進行了豬復紅細胞體、圓環病毒、弓形蟲等疾病的病原體檢測，檢測結果為陰性，對鏈球菌的病原體檢測從細菌分離培養、染色鏡檢、生化試驗、PCR等方面鑒定分離到的病原為鏈球菌，從而確診該豬場發生了豬鏈球菌病。

鏈球菌具有多種細菌且在自然界中廣泛分布，引起許多動物（如人、豬、牛、馬、綿羊和家禽等）的感染。豬鏈球菌的特征是敗血癥和局灶性淋巴結病。豬鏈球菌感染豬的生殖和消化道、上呼吸道。其中，以Ⅱ型豬鏈球菌最常見、毒性最強。致病因素包括膠囊、溶菌酶釋放蛋白（MRP）、細胞外因子（EF）和溶血素。這種膠囊可以防止細菌被吞噬。溶菌酶釋放蛋白和細胞外因子的存在增強了菌株的毒力。這種細菌的抵抗力不強，對干燥、濕熱比較敏感，常用的消毒劑就可以殺滅它。

鏈球菌為革蘭氏陽性菌，在理論上許多抗生素對其具有明顯的抗菌作用。藥敏試驗結果表明，分離到的鏈球菌對頭孢曲松、哌拉西林、氨芐西林、呋喃唑酮等藥物具有較高的敏感性，而其對環丙沙星、紅霉素、慶大霉素、阿莫西林、諾氟沙星等藥物不敏感，主要是由于該豬場在生產過程使用了大量的抗生素，導致耐藥菌株的產生。通過藥敏試驗篩選合適藥物，結合豬場實際生產情況，確定合理的用藥方案，選擇合適的路徑和劑量，可有效控制疫情的發生。劉佩紅等[10]研究表明不同豬場對藥物的耐藥性也不同，也說明在豬場日常生產中進行臨床用藥時，應盡可能采用輪換用藥、聯合用藥等方式，避免耐藥菌株的產生[11]。

參考文獻

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