克氏原螯蝦肝胰腺病原菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)

唐慶權(quán)　韓陽　許曉牧　朱若林　鮑傳和　江河　宋光同　彭開松

摘要 分離并鑒定克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）致病的疑似病原，并篩選有效內(nèi)服藥物。共鑒定出8種細(xì)菌，分別為乙酰外桿菌、費(fèi)氏檸檬酸桿菌、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、蜂房哈夫尼亞菌、擬態(tài)弧菌、魯氏耶爾森菌。從患病克氏原螯蝦肝胰腺中分離的主要病原菌是檸檬酸菌屬和氣單胞菌屬的成員，而不是弧菌。恩諾沙星和氟苯尼考對上述菌有較好的治療效果。

關(guān)鍵詞 克氏原螯蝦;費(fèi)氏檸檬酸桿菌;氣單胞菌屬;恩諾沙星;氟苯尼考

中圖分類號 S945.1+2文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）21-0096-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.028

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Isolation，Identification and Drug Sensitivity Test of Pathogen from the Hepatopancreas of Diseased Crayfish

TANG Qingquan，HAN Yang，XU Xiaomu et al

（Laboratory of Aquatic Health and Public Health，School of Animal Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei，Anhui 230036）

Abstract The suspected pathogens of Procambarus clarkii was isolated and identified，and effective oral medicines were screened out.Eight kinds of bacteria were identified，including Exiguobacterium acetylicum，Citrobacter ferguerii，Aeromonas veronii，Aeromonas hydrophila，Klebsiella pneumoniae，Hafnia paralvei，Vibrio mimicus and Yersinia ruckeri. The main pathogenic bacteria isolated from thehepatopancreas of diseased P.clarkii were the members of the genus Citrobacter and Aeromonas，not Vibrio.Enrofloxacin and florfenicol had better control effects on the above bacteria.

Key words Procambarus clarkii;Citrobacter fischeri;Aeromonas;Enrofloxacin;Florfenicol

基金項(xiàng)目 安徽省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（皖農(nóng)科〔2016〕84號）。

作者簡介 唐慶權(quán)（1995—），男，安徽霍邱人，碩士研究生，研究方向：水生動物疾病與漁用保健品研發(fā)。通信作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事養(yǎng)殖健康與公共衛(wèi)生研究。

收稿日期 2019-04-12;修回日期 2019-04-24

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii ），又稱紅色沼澤螯蝦或小龍蝦，隸屬甲殼綱十足目螯蝦科原螯蝦屬，在我國主要分布在江蘇、浙江、湖北、湖南、安徽、上海、山東等省（市）。國內(nèi)報道的克氏原螯蝦病原包括維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）[1]、費(fèi)氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）[2]、螺原體（Spiroplasma）[3] 等。筆者所在課題組整理了2017—2018年從舒城、定遠(yuǎn)、霍山、肥西、長豐、太湖等養(yǎng)殖場稻蝦田中的瀕死克氏原螯蝦肝胰腺分離到的病原菌鑒定和藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以期為克氏原螯蝦細(xì)菌性疾病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基、藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購于生物工程（上海）股份有限公司;TaN DNA聚合酶購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;DNA膠回收試劑盒購于愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司;抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.2 臨床診斷分析 對各養(yǎng)殖場發(fā)病前后的養(yǎng)殖管理、水質(zhì)情況和寄生蟲進(jìn)行了臨床分析。

1.3 細(xì)菌分離、純化及鑒定 將瀕死的克氏原螯蝦（全長7～8 cm）進(jìn)行體表消毒后，在無菌操作臺完成解剖操作。解開頭胸甲，將肝胰腺的截面涂布于營養(yǎng)瓊脂平面上，用營養(yǎng)瓊脂分離純化細(xì)菌。

將純化的細(xì)菌置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，觀察菌落形態(tài);鑒定細(xì)菌，參照朱若林等[4]的方法進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增和系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.4 患病蝦內(nèi)服藥物的篩選 參考?xì)W盟標(biāo)準(zhǔn)[5]，采用紙片法和微量肉湯稀釋法進(jìn)行內(nèi)服抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)。敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)如下：

7 mm≤抑菌圈直徑≤14 mm，判為R（耐藥）;抑菌圈直徑≥20 mm，判為S（敏感）;15 mm≤抑菌圈直徑≤19 mm，判為I（中敏）。藥敏紙片直徑約6 mm、厚度約1 mm，平板瓊脂餅的平均厚度約5 mm。

微量肉湯法結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下。 磺胺甲噁唑：最小抑菌濃度>152 μg/μL，為耐藥;20 μg/μL≤最小抑菌濃度≤152 μg/μL，為中敏;最小抑菌濃度≤19 μg/μL，為敏感。恩諾沙星、多西環(huán)素：最小抑菌濃度>32 μg/μL，為耐藥;9 μg/μL≤最小抑菌濃度≤32 μg/μL，為中敏;最小抑菌濃度≤8 μg/μL，為敏感。氟苯尼考和硫酸新霉素：最小抑菌濃度>16 μg/μL，為耐藥;5 μg/μL≤最小抑菌濃度≤16 μg/μL，為中敏;最小抑菌濃度≤4 μg/μL，為敏感。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

各養(yǎng)殖場發(fā)病田水溫均為25～28 ℃，各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)良好，癥狀為病蝦不攝食，螯足無力，行動遲緩，應(yīng)激能力較弱; 部分個體體表皮膚變黑，甲殼內(nèi)壁無白斑及其他明顯癥狀，經(jīng)解剖可見肝胰臟顏色淡黃。水浸片檢查未發(fā)現(xiàn)寄生蟲。

2.2 細(xì)菌16S rRNA鑒定

實(shí)驗(yàn)室累計從各地瀕死克氏原螯蝦分離純化到30株細(xì)菌，并對30株菌的16S rRNA基因測序進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果見表1，分別與對應(yīng)參考株的相似性在99%以上。

其中，費(fèi)氏檸檬酸桿菌和維氏氣單胞菌為優(yōu)勢種，分別占病原菌數(shù)的43.3%和26.67%。以上克氏原螯蝦患病是由細(xì)菌混合感染所致，其中費(fèi)氏檸檬酸和氣單胞菌屬為主要疑似致病菌。費(fèi)氏檸檬酸桿菌和維氏氣單胞菌的進(jìn)化樹如圖1

所示。采用 Mega 4軟件進(jìn)行多序列匹配分析后，采用鄰位相連法（neighborjoining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，所構(gòu)建發(fā)育樹各分支的置信度由 Bootstrap 進(jìn)行 1 000 次循環(huán)檢驗(yàn)。

2.3 藥敏試驗(yàn)

匯總統(tǒng)計分離株對常用國標(biāo)抗菌漁藥敏感、中敏、耐藥的菌株數(shù)量，見表2和表3。綜合紙片法和肉湯法測定結(jié)果可知，分離株對氟苯尼考或恩諾沙星的敏感性較高。

3 討論

筆者從患病克氏原螯蝦肝胰腺中分離的細(xì)菌共8種，作為克氏原螯蝦已知病原菌的有費(fèi)氏檸檬酸桿菌[2]、維氏氣單胞菌[1]、嗜水氣單胞菌[6]、擬態(tài)弧菌[7]，而乙酰外桿菌、哈夫尼亞菌、肺炎克雷伯氏菌、魯氏耶爾森菌是否對克氏原螯蝦有致病性目前尚未見報道。

弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）是一種典型的人-畜-魚共患條件性致病菌，陸生動物和人均可感染致病性弗氏檸檬酸桿菌而發(fā)生腹瀉、食物中毒和繼發(fā)感染[8-9]。近些

年，關(guān)于弗氏檸檬酸桿菌致水產(chǎn)動物患病的報道越來越

多[10-11] 。維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌均是淡水水生動物

的重要病原菌和重要新發(fā)人-獸-魚共患病原[12-13]。擬態(tài)弧菌也是一種重要的人-獸-魚的重要病原菌，可引起水產(chǎn)動物的腹水病，引起人類腹瀉和食物中毒[14]。目前乙酰外桿菌、哈夫尼亞菌、魯氏耶爾森菌并沒有出現(xiàn)報道致病水產(chǎn)動物的病例，盧玉婷等[15]從鯉魚中分離鑒定出肺炎克雷伯氏菌。

陳紅蓮等[2]和彭博文等[1]研究表明費(fèi)氏檸檬酸桿菌對恩諾沙星和新霉素敏感，對四環(huán)素和復(fù)方新諾明中度敏感。維氏氣單胞菌對磺胺異噁唑、氟苯尼考、新霉素、多西環(huán)素等藥物高度敏感，其藥敏結(jié)果與該藥敏試驗(yàn)結(jié)果相一致。

筆者從安徽省6個縣患病克氏原螯蝦中分離到30株細(xì)菌，鑒定出8種疑似病原菌。雖然氟苯尼考或恩諾沙星敏感性較高，但也有20%分離株有耐藥性。因此，在水生動物病害防控時，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)非常有必要。

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