ARTP-NTG復合誘變選育高產中性蛋白酶菌株

錢娟娟　王克芬　宋靜靜　劉勝利　王興吉　劉文龍

摘要 以枯草芽孢桿菌A-06為出發菌株，利用ARTP-亞硝基胍（NTG）復合誘變方法對該菌株進行遺傳改造。經過平板初篩，搖瓶復篩，最終篩選出一株酶活提高明顯、遺傳穩定的菌株N-36。其搖瓶發酵酶活達29 500 U/mL，較出發菌株酶活提高90%左右。

關鍵詞 中性蛋白酶;ARTP;NTG;復合誘變;篩選

中圖分類號 Q933文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）21-0005-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.002

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Screening of High Neutral Protease Producing Strains by ARTPNTG Compound Mutagenesis

QIAN Juanjuan， WANG Kefen， SONG Jingjing et al

（Shandong Long Kete Enzyme Co.， Ltd.， Shandong Province Key Laboratory of Enzyme Preparation Fermentation Technology， Linyi， Shandong 276400）

Abstract The original strain of Bacillus subtilis A06 was modified in genetic characteristics by ARTPNTG compound mutagenesis. One high neutral proteaseyielding strain N36 was screened from the mutants by slab screening and shake flask rescreening， which the enzyme activity increased obviously and had good genetic stability. The enzyme activity of the shake flaskfermentation reached 29 500 U/mL， which was 90% higher than that of the original strain.

Key words Neutral protease;ARTP;NTG;Compound mutagenesis;Screen

基金項目 國家重點研發計劃（2017YFB0308400）。

作者簡介 錢娟娟（1983—），女，山東威海人，工程師，碩士，從事酶制劑生產與開發工作。通信作者，工程師，碩士，從事酶制劑生產與開發工作。

收稿日期 2019-05-16

中性蛋白酶主要是由微生物發酵提取而得的，可用于各種蛋白質水解處理，水解產物為氨基酸、小肽等[1]。它是被最早發現并廣泛應用于工業化生產的蛋白酶制劑，可用于皮革脫毛、畜禽血液蛋白質水解、酒和飲料的澄清以及醫藥治療等領域[2-5]。近年，也有應用于多肽制備、降解棉酚、破乳等的相關研究[6-9]。相對國外酶制劑活性來說，國產酶制劑活性很低，而酶制劑活性的提高，關鍵需要采用合適的技術手段來選育高產菌種。

誘變選育具有優良性狀的微生物菌種是發酵工業的關鍵環節，而誘變方法的選擇是菌種選育能否成功的關鍵[10]。其方法有多種，如物理誘變、化學誘變及基因工程育種等[11-13]。新型的常壓室溫等離子體（ARTP）誘變育種技術在具有操作簡易、條件溫和的基礎上，可達到一次誘變便能獲得2萬個以上突變體的大庫容高效誘變[14-15]。亞硝基胍（NTG）作為一種超強誘變劑，是公認效果顯著的化學超誘變劑。該研究擬采用ARTP-NTG復合誘變技術處理對數生長期的中性蛋白酶菌液，篩選酶活提高的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發菌株。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），山東隆科特酶制劑有限公司菌種實驗室保藏。

1.1.2 主要儀器與設備。

ARTP-IIS常壓室溫等離子體誘變系統（無錫思清源生物科技有限公司）;

ZXSD-A1270生化培養箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）;

ZWF-B3612搖瓶機（上海智誠分析儀器制造有限公司）;

5810R離心機（德國Eppendorf公司）;

Plus384酶標儀（美國MD公司）;

UV-1800紫外可見分光光度計（日本島津公司）。

1.1.3 試劑。

蛋白胨、酵母粉（美國BD公司）;

酵母膏、牛肉膏（北京奧博星生物技術有限責任公司）;

葡萄糖、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鋅、瓊脂粉、酪蛋白均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）;

玉米淀粉、豆餅粉、麩皮（市售）。

1.1.4 培養基。

1.1.4.1 分離篩選培養基。蛋白胨1.00%、牛肉膏0.5%、氯化鈉0.5%、酪蛋白1.00%、瓊脂粉2.00%，pH 7.0。

1.1.4.2 種瓶培養基。蛋白胨1.00%、牛肉膏0.5%、酵母膏030%、葡萄糖1.00%、氯化鈉0.2%，pH 7.0。

1.1.4.3 搖瓶培養基。玉米淀粉6.30%、豆餅粉2.00%、麩皮250%、Na2HPO4·12H2O 0.20%、KH2PO40.04%、ZnCl2 005%，pH 7.0。

3 結論

采用ARTP-亞硝基胍（NTG）復合誘變的方式對出發菌株枯草芽孢桿菌A-06進行遺傳改造，經平板篩選，搖瓶發酵

培養，篩選到一株遺傳穩定性良好的突變菌株N-36，其發酵

酶活力相對于出發菌株提高90%左右。試驗結果表明，產中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌通過ARTP-NTG復合誘變，其誘變效應大大提高，該研究為選育具有優良性狀的微生物菌種提供了依據。

參考文獻

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