不同紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)替代兔眼刺激性實(shí)驗(yàn)比較研究

劉興國(guó)　白雯靜　田妮娜　李巖　劉荔

【摘 要】目的：探討不同種屬紅細(xì)胞在溶血實(shí)驗(yàn)中替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面的差異性。方法：選用20批次洗發(fā)劑進(jìn)行家兔眼刺激實(shí)驗(yàn)，使用同批次樣品進(jìn)行兩種不同哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)，根據(jù)各自不同的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：按照相應(yīng)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，綿羊紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析結(jié)果：Kappa=0.426，Spearman相關(guān)系數(shù)為0.598，豬紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析結(jié)果：Kappa=0.531，Spearman相關(guān)系數(shù)為0.464。兩種動(dòng)物紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比分析結(jié)果，Kappa=0.358，Spearman相關(guān)系數(shù)為0.413。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明兩種實(shí)驗(yàn)方法有一定的相關(guān)性，紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)?zāi)茉谝欢ǚ秶鷥?nèi)取代兔眼刺激實(shí)驗(yàn)，且紅細(xì)胞種屬不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

【關(guān)鍵詞】化妝品;眼刺激性實(shí)驗(yàn);替代方法;紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)： S481.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 2095-2457（2019）32-0232-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.32.109

A Comparative Study of Different Hemolysis Experiments Instead of Rabbit Eye Stimulation Experiments

LIU Xing-guo BAI Wen-jing TIAN Ni-na* LI Yan LIU Li

（Lanzhou institute for food and drug control， Lanzhou Gansu 730050，China）

【Abstract】Objective： To explore the differences of red blood cells of different species in the hemolysis experiment instead of the animal experiment. Methods： 20 batches of shampoo were selected for rabbit eye irritation test， and the same batch of samples were used for red blood cell hemolysis test of two different mammals. According to different grading standards， the correlation between red blood cell hemolysis test and animal experiment was analyzed. Results： According to the corresponding grading standards， the comparative analysis results of sheep red blood cell hemolysis test： Kappa=0.426， Spearman correlation coefficient 0.598， and pig red blood cell hemolysis test： Kappa=0.531， Spearman correlation coefficient 0.464. The comparative analysis results of erythrocyte hemolysis test results of the two animals showed that Kappa=0.358 and Spearman correlation coefficient was 0.413. Conclusion： The experimental results show that there is a certain correlation between the two experimental methods. Red blood cell hemolysis test can replace rabbit eye stimulation test in a certain range， and the red blood cell species does not affect the experimental results.

【Key words】Cosmetics; Eye irritation test; Alternative methods; Erythrocyte hemolysis test

兔眼刺激性試驗(yàn)（Draize 試驗(yàn)）是指動(dòng)物眼球接觸到化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的過(guò)程，是目前評(píng)估眼刺激性的金標(biāo)準(zhǔn)[1-2]，通過(guò)實(shí)驗(yàn)人員肉眼觀察血紅蛋白的漏出和變性進(jìn)行評(píng)分，方法周期長(zhǎng)、成本高，存在一定的主觀性和差異性;同時(shí)，隨著動(dòng)物保護(hù)運(yùn)動(dòng)的興起和人們對(duì)“3R”運(yùn)動(dòng)的關(guān)注[3]，體外替代試驗(yàn)的研究已廣泛開(kāi)展[4-7]。

本研究擬通過(guò)20批次洗發(fā)類(lèi)產(chǎn)品驗(yàn)證考察紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用于此類(lèi)化妝品眼刺激性評(píng)價(jià)的可能性及不同種屬血樣的差異性。

1 材料與方法

1.1 樣品

全部樣品均來(lái)源于蘭州市藥品檢驗(yàn)所送檢的化妝品，共20個(gè)批次樣品，均為洗發(fā)類(lèi)。

1.2 綿羊紅細(xì)胞懸液、豬紅細(xì)胞懸液購(gòu)自北京博爾西科技有限公司，100mL/瓶，其中紅細(xì)胞濃度為2×108個(gè)/mL，4℃條件下保存，1個(gè)月內(nèi)使用。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大耳白兔，普通級(jí)，雌雄兼用，雌性未孕，購(gòu)自蘭州畜牧獸醫(yī)研究所，并飼養(yǎng)在蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所藥理室普通級(jí)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證：SCXK（甘）2015-0001號(hào)。

1.4 主要儀器及試劑

主要儀器：艾本德紫外分光光度計(jì)BioSpectrometer basic，低溫高速離心機(jī)Centrifuge5424R，電子天平 MS205DU，控溫?fù)u床KS4000。PBS（Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，NaCl8g，KCl0.2g，溶于1000ml純化水中，pH為7.4，121℃滅菌30min），十二烷基硫酸鈉（SDS）（1000mg/L）。

1.5 紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)

先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)預(yù)測(cè)樣品的HD50范圍。樣品用PBS配制成濃度為10000mg/L（w/v）的貯備液，超聲振蕩使其完全溶解。取不同濃度的樣品溶液（逐級(jí)稀釋貯備液至1000mg/L、100mg/L、10mg/L、1mg/L）。取不同濃度的受試樣品溶液、PBS、0.01%十二烷基硫酸鈉、蒸餾水各1.5mL于試管內(nèi)，分別各加入0.5mL綿羊紅細(xì)胞懸液、豬紅細(xì)胞懸液充分混勻。在32℃水浴中振蕩孵育30min，然后以10000r/min的速度離心2min，取上清液，分別讀取540nm、560nm、575nm波長(zhǎng)下的吸光度（A）。以560nm的Abs計(jì)算溶血率（HR）：HR=A受試管/A全溶管×100%，預(yù)測(cè)受試樣品導(dǎo)致半數(shù)紅細(xì)胞溶血的濃度范圍，以指導(dǎo)正式實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品濃度的設(shè)置。根據(jù)預(yù)試結(jié)果調(diào)整各受試樣品濃度。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)置5個(gè)樣品濃度，實(shí)驗(yàn)方法同預(yù)實(shí)驗(yàn)。溶血率的計(jì)算同預(yù)實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算血紅蛋白變性指數(shù)（DI）=R樣品/RSDS×100%，R樣品、RSDS分別為樣品和SDS上清液A575/A540值。主要觀察指標(biāo)：50%紅細(xì)胞發(fā)生溶血時(shí)的樣品濃度（HD50）、蛋白質(zhì)變性指數(shù)（DI）、HD50與變性變性指數(shù)DI的比值（IP=HD50/DI）。

家兔眼刺激實(shí)驗(yàn)按《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007）對(duì)受試樣品進(jìn)行眼刺激性分級(jí)[8]。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

以受試樣品濃度為橫坐標(biāo)，溶血率為縱坐標(biāo)作直線回歸，根據(jù)直線回歸方程計(jì)算導(dǎo)致50%紅細(xì)胞溶解時(shí)的樣品濃度（HD50值），同時(shí)計(jì)算DI和IP。應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。以兔眼刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)系數(shù)的計(jì)算，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)刺激性分級(jí)結(jié)果和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分級(jí)結(jié)果進(jìn)行比較，判斷兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果分級(jí)的頻數(shù)差別是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果

紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)的分級(jí)為：IP≥100、10≤IP<100、1≤IP<10、0.1≤IP<1和IP<0.1分別表示無(wú)刺激性、微刺激性、輕刺激性、刺激性和嚴(yán)重刺激性5個(gè)級(jí)別[9]。溶血率與樣品濃度存在一定的線性關(guān)系，以樣品濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，溶血率為縱坐標(biāo)可求得HD50值（R2≥0.95）。同時(shí)求得HD50時(shí)的 DI 和IP。

2.2 兔眼刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為無(wú)刺激性、微刺激性、輕刺激性、刺激性和嚴(yán)重刺激性5個(gè)級(jí)別。20批洗發(fā)劑中，等級(jí)為無(wú)刺激性的樣品11種，微刺激性樣品7種，輕刺激性2種。

3 統(tǒng)計(jì)分析

（1）綿羊紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果和兔眼刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Kappa=0.426，認(rèn)為兩者分級(jí)一致性尚可;Spearman相關(guān)系數(shù)為0.598，說(shuō)明兩者之間存在一定的相關(guān)性。

（2）豬紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果和兔眼刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Kappa=0.531，認(rèn)為兩者分級(jí)一致性尚可;Spearman相關(guān)系數(shù)為0.464，說(shuō)明兩者之間存在一定的相關(guān)性。

（3）兩種動(dòng)物紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)后結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Kappa=0.358，兩者分級(jí)相對(duì)一致;Spearman相關(guān)系數(shù)為0.413，兩者之間存在一定的相關(guān)性。

4 討論

紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的一種替代方法，雖然具有一定的局限性，但仍不失為一種可靠性較高的組合策略之一。其本質(zhì)為化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜的破壞從而引起一系列的炎性反應(yīng)。不同結(jié)構(gòu)化合物損傷紅機(jī)制有較大差異，這就限制了該實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用范圍。本實(shí)驗(yàn)選擇溶血和血紅蛋白變性兩個(gè)檢測(cè)指標(biāo)，采用2種哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行兔眼刺激性實(shí)驗(yàn)，探討紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)替代傳統(tǒng)眼刺激實(shí)驗(yàn)用于化妝品眼刺激性評(píng)價(jià)的可靠性，并對(duì)血液來(lái)源種屬差異是否會(huì)對(duì)眼刺激替代實(shí)驗(yàn)的結(jié)果造成影響進(jìn)行了初步評(píng)估。結(jié)果顯示，兩種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定刺激性范圍內(nèi)存在相當(dāng)?shù)囊恢滦裕砻骺勺鳛榛瘖y品眼刺激性的評(píng)價(jià)的初篩手段，兩種種屬紅細(xì)胞替代實(shí)驗(yàn)與兔眼刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性和相關(guān)性程度接近，故認(rèn)為紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)替代兔眼刺激性實(shí)驗(yàn)不存在種屬差異。

紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單快速，具有較好的眼刺激性預(yù)測(cè)能力，作為化妝品眼刺激性的篩選策略，是一種比較有潛力的離體替代方法，也很有可能成為替代實(shí)驗(yàn)的組合實(shí)驗(yàn)中的重要組成部分，將來(lái)如能加強(qiáng)在比色方面的研究，有希望成為一種可靠地快速檢驗(yàn)方法。本研究中遇到的問(wèn)題以及方法的局限性：溶血實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不同化合物對(duì)紅細(xì)胞膜的破壞有差別，且本研究中樣品刺激性范圍有限，不能從整體上反映出溶血作用的范圍;在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，樣品所含色素影響吸光度的測(cè)定，有可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，且前處理過(guò)程時(shí)間較長(zhǎng)影響到對(duì)紅細(xì)胞的溶解性，這些問(wèn)題都是將來(lái)需要進(jìn)一步研究并解決的。

【參考文獻(xiàn)】

[1]程樹(shù)軍，焦紅.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法原理與應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社，2010：285-304.

[2]Eloisa NA，Rosaura de FP，Octuvio AFP，et al.A Reassessment of the In Vitro RBC Haemolysis Assay with Defibrinated Sheep Blood for the Determination of the Ocular Irritation Potential of Cosmetic Products：Comparison with the In Vivo Draize Rabbit Test[J].ATLA，2008，21（12）：275-284.

[3]Balls M， Riddell RJ， Worden AN.Animal and alternatives in Toxicity Testing. London： Academic Press， 1983.Balls M，Riddell RJ， Worden A N， Animal and alternatives in Toxicity Testing.London： Academic Press， 1983.

[4]Hayashi T， Itagaki H， Fukuda T， et al.Multivariate factorial analysis of data obtained in seven in vitro test systems for predicting eye irritancy. Toxicology in vitro.1994;8：215-220.

[5]張文改，楊杏芬.眼刺激實(shí)驗(yàn)的替代方法及應(yīng)用策略研究進(jìn)展[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，33（1）：27-31.

[6]張文改，楊杏芬.基于細(xì)胞的眼刺激性體外替代方法建立與化妝品限刺激性逐步檢測(cè)策略的初步研究（碩士學(xué)位論文）[D].廣州：中山大學(xué)，2007：15-18.