博來霉素和內毒素誘導兩種品系小鼠肺纖維化模型的比較研究*

何文涓 吳小瑜 袁志堅 黃 寅

(無錫衛生高等職業技術學校，無錫 214028)

特發性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種原因不明的慢性間質性肺疾病[1-2]。其病理特征主要為彌漫性肺泡炎、成纖維細胞病理性增長和細胞外基質在肺間質及肺泡腔沉積等，造成肺組織結構的破壞，最終導致慢性呼吸衰竭。肺纖維化是肺受損后的一種并發癥，其預后極差，5年生存率不到50%，目前對于肺部纖維化類疾病的治療手段有限，建立穩定而可靠的肺間質纖維化模型是探索其發病機制和開發有效治療藥物的重要保障[3-5]。

目前肺纖維化動物模型采用的主要是嚙齒類動物，如小鼠、大鼠、倉鼠等，小鼠具有繁殖快、飼養管理費用低等特點，是科研工作者最常選用的動物[6]。肺纖維化誘導劑主要包括博萊霉素 (Bleomycin, BLM)、內毒素、胺碘酮、百草枯、石棉、二氧化硅、放射線、高濃度氧、野百合堿、呼吸道腸道病毒等，其中以博來霉素和內毒素最為常用[7-9]。本研究以ICR、C57BL/6兩個品系小鼠為研究對象，以博來霉素和內毒素為肺纖維化誘導劑，尋找最適合復制肺纖維化模型的小鼠及誘導劑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級ICR小鼠90只、清潔級C57BL/6小鼠90只，雄性，6～8周齡，體質量18～22 g，浙江省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(浙)2017-0001。

1.2 試劑與儀器

博來霉素：海正輝瑞制藥有限公司；內毒素：湛江安度斯生物有限公司；羥脯氨酸試劑盒：南京建成生物研究所。

1.3 方法

1.3.1分組:將ICR小鼠隨機分為對照組、博來霉素組、內毒素組，每組30只；將C57BL/6小鼠隨機分為對照組、博來霉素組、內毒素組，每組30只。

1.3.2小鼠肺纖維化模型建立

博來霉素組：腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg體質量)，小鼠麻醉后將其固定在30°傾角的鼠板上，在頸部開一個小口暴露氣管，用微量進樣器插入氣管注博來霉素(5 mg/kg)，注射完畢后將小鼠直立左右輕微搖晃10 min，使藥液均勻分布于雙肺，完畢后縫合皮膚，在傷口處擦碘酒消毒。

內毒素組：內毒素以生理鹽水溶解，按40 EU/kg劑量一次性尾靜脈注射。

對照組：用與博來霉素同體積的生理鹽水氣管灌注。

分別于造模后第7、14、28天每組隨機處死8只小鼠進行后續試驗。

1.4 肺系數測定

將各組小鼠沿腹部剪開，完整分離肺組織，用生理鹽水沖洗肺組織3遍，用濾紙吸干后稱得肺濕重，計算肺系數，肺系數=肺濕重(g)/體質量(kg)。右肺置于4%甲醛溶液中固定，其余肺組織放于凍存管中，先浸沒于液氮1 h，后轉移至-80 ℃冰箱中保存。

1.5 小鼠肺組織病理學檢查

取右肺組織，用4%甲醛浸泡過夜固定，制備石蠟切片，做HE染色。在光學顯微鏡下觀察肺組織病理學改變。

1.6 ELISA檢查肺組織羥脯氨酸

取部分肺組織，稱重剪碎后與對應體積的PBS(質量體積比1 g：9mL)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨2 min，5 000×g離心10 min，取上清，用BCA法將不同組上清溶液調至相同蛋白濃度。采用ELISA法檢測各組小鼠肺組織中羥脯氨酸(HYP)含量。

1.7 統計方法

2 結果

2.1 兩個品系小鼠一般情況

ICR和C57BL/6小鼠中的對照組均狀態良好，飲食飲水正常，體質量不同程度增加。相比于對照組，兩個品系的博來霉素和內毒素組小鼠在造模后均出現不同程度的體質量減輕，活躍度減少等情況。其中C57BL/6的博來霉素組和內毒素組小鼠體質量下降最顯著。ICR博來霉素組小鼠在第7天開始出現死亡，直至第28天共3例死亡；C57BL/6博來霉素組小鼠在第4天開始出現死亡，直至第28天共5例死亡。ICR的內毒素組和C57BL/6的內毒素組小鼠無死亡現象。

2.2 小鼠肺系數

肺系數可以反映單位質量下肺濕重的變化，是反映肺纖維化程度的一個重要指標。兩個品系的博來霉素組和內毒素組小鼠的肺系數在第7、14、28天均高于對照組(P<0.05)。其中對于同一種肺纖維化誘導劑，C57BL/6品系的小鼠肺系數在第14、28天與ICR品系小鼠相比，肺系數升高(P<0.05)。對于同一品系小鼠，博來霉素組肺系數與內毒素組相比，無顯著性差異(P>0.05)。結果見表1。

表1 兩個品系小鼠肺系數的比較Table 1 Comparison of lung coefficient between two strains of

2.3 肺病理形態改變

ICR和C57BL/6的對照組小鼠細支氣管和肺泡結構完整，襯附正常纖毛柱狀上皮及肺泡上皮，間質僅見少量炎性細胞浸潤，毛細血管正常；兩個品系的博來霉素組和內毒素組小鼠均出現不同程度的肺纖維化，肺組織支氣管和肺泡結構紊亂，間質見較多慢性炎細胞浸潤，并可見纖維組織增生。相比于ICR博來霉素組和內毒素組的小鼠，C57BL/6博來霉素組和內毒素組小鼠肺纖維化程度更高，肺組織內炎性細胞浸潤、肺泡壁斷裂及肺泡腔融合不同程度增加。結果見圖1。

2.4 小鼠肺組織中羥脯氨酸含量的比較

ICR和C57BL/6的博來霉素組和內毒素組小鼠肺組織中羥脯氨酸含量在第14、28天均高于對照組(P<0.05)。其中對于同一種肺纖維化誘導劑，C57BL/6品系的小鼠肺組織中羥脯氨酸含量在第7、14、28天與ICR品系小鼠相比，含量升高(P<0.05)。對于同一品系小鼠，博來霉素組小鼠的肺組織中羥脯氨酸含量與內毒素組小鼠相比，無顯著性差異(P>0.05)。結果見圖2。

圖2 兩個品系小鼠肺組織HYP含量注：兩個品系分別于對應的對照組小鼠比較，*P<0.05；與另一品系對應的相同組別小鼠比較，#P<0.05Fig.2 HYP content in lung tissue of two strains of Note：The two strains were compared in the corresponding control mice, *P<0.05; compared with the same group of mice corresponding to another strain,#P<0.05

3 討論

博來霉素是從輪狀鏈霉菌(Streptomycesverticillatus)中分離出來的，可有效對抗鱗狀細胞癌和皮膚腫瘤，然而其抗腫瘤作用具有引起肺纖維化的副作用[10]。博來霉素誘導的動物肺纖維化模型與人類肺纖維化過程相似度較高，是國內外常用的肺纖維化誘導劑，常用的方法是通過氣管給藥[11]。

內毒素是革蘭陰性菌細胞壁成分，其化學性質為脂多糖(LPS)，耐熱而穩定，不易被破壞，在動物體內可引起發熱反應、白細胞反應甚至內毒素性休克，是臨床上引起急性肺損傷的重要因素[12-13]。國內外已有一些學者采用內毒素制備急性肺損傷肺纖維化模型，可通過氣道、腹腔及靜脈等多種途徑給藥[8,14]。

C57BL/6是一種常用的近交品系實驗鼠，群體反應性比較均一。C57BL/6 小鼠肺組織的組織學結構接近于人類，其作為肺纖維化的模型能夠模擬人的肺纖維化的發病機制和過程[15-16]。ICR小鼠是一類繁殖力、抗病力和適應力均很強的遠交群小鼠，被廣泛應用于藥理學、毒理學等多種領域的研究[17]。

本研究顯示在造模后的第14、28天，C57BL/6的博來霉素組和內毒素組均出現不同程度的肺纖維化，其中對于同一種肺纖維化誘導劑，C57BL/6品系小鼠的肺纖維化程度與ICR品系小鼠相比，有顯著差異。對于同一品系小鼠，博來霉素組的肺纖維化程度與內毒素組相比，無顯著差異。實驗結果表明，C57BL/6小鼠較ICR小鼠更適合復制博來霉素和內毒素誘導的肺纖維化動物模型，但這兩種肺纖維化動物模型形成機制的差異性及適用條件需要進一步研究。