3株少孢節叢孢菌分離株通過綿羊消化道試驗的評估

潘 紅，羅斌漢，趙睿明，曾曼溢，孫雨琪，羅千慧，候俊達，蔡葵蒸

（西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

家畜寄生蟲病是危害我國畜牧業經濟生產效益的主要因素之一。目前，人們對家畜寄生蟲病危害的處理方式主要依賴于藥物防治，并相繼研發了一系列高效、廣譜、低毒的驅蟲藥，這對家畜寄生蟲病的防控發揮了重要作用。但隨著驅蟲藥的長期使用，導致寄生蟲對藥物產生了耐藥性[1,2]。長期使用藥物不僅會導致家畜體弱消瘦，而且家畜體內殘留的藥物還會給人們的身體健康帶來安全隱患，藥物殘留也會對環境造成一定的污染。所以，生物防控成為了未來寄生蟲病防治的主要研究方向[3,4]。研究發現，土壤中含有多種捕食性線蟲真菌，可以通過形成特殊的菌絲結構來感染線蟲，篩選和利用這些真菌作為植物和動物寄生線蟲的生物防治劑，具有廣闊的應用前景，其中少孢節叢孢（A.oligospora）是自然界最為常見而且目前最為廣泛和深入研究的一種捕食性線蟲真菌[5-8]。本研究的目的是進一步探討該菌通過消化道后對體內幼蟲的捕殺效果，為今后利用這種捕食性真菌開展動物寄生線蟲病的生物防治提供依據。

1 材料和方法

1.1 菌種

少孢節叢孢 (A. oligospora)，分離株編號為F35、F88和F79，這3株菌均來自西北民族大學蔡葵蒸教授課題組，菌株在4 ℃下2%玉米粉瓊脂斜面培養基保存。

1.2 培養基及其制備

本研究使用的培養基主要為水瓊脂培養基（WA），麩皮瓊脂培養基（WSA），液體培養基，產孢培養基。

水瓊脂培養基（WA）：按照2%的濃度將瓊脂粉加入到水中，高壓滅菌后在超凈工作臺內倒制平板。

麩皮瓊脂培養基（WBA）：4%麩皮原液的制備：稱量40 g麩皮，量取1 000 ml水，加熱保持微沸一小時并不斷攪拌。八層紗布過濾后，置于2 000 ml量筒用保鮮膜密封（量筒里的水加至1 000 ml），6 ℃冰箱靜置10 h，吸取上清液，稀釋至所需濃度，再加入2%的瓊脂粉。高壓滅菌后，在超凈工作臺內倒制平板。

液體培養基：按照上述方法制備濃度為4%的麩皮原液，稀釋至2%。每個錐形瓶加入80 ml稀釋好的2%麩皮原液，高壓滅菌121 ℃，20 min即可。

產孢培養基：糧食培養基的總重量為60 g，主要成分是玉米和小麥，其比例是2：1，按照比例稱取小麥和玉米放入250 ml錐形瓶加入1 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4以及適量的蒸餾水，糧食與蒸餾水的比例是1.5：1，用硅膠塞蓋住并用牛皮紙將其瓶口包好，整體放入高壓鍋內，溫度設置為121 ℃，時間為30 min進行高壓蒸汽滅菌即可。

1.3 菌種的擴繁和分生孢子的生產

在超凈工作臺內，將2%玉米粉瓊脂斜面培養基保存的菌株在無菌條件下用接種環挑出少量菌絲體連同培養基，接種在WA培養基中央，置于28 ℃培養箱中培養一星期左右。若WBA平板培養基中接種的真菌生長良好，則可以在超凈工作臺內將已培養好的真菌用滅菌的手術刀切下5 mm×5 mm大小的布滿菌絲的瓊脂塊接種到液體培養基中，每瓶5塊，放置在轉速為160 r/ min，溫度為28 ℃的搖床中培養5～7 d后，在超凈工作臺內使用震蕩儀上震蕩5 min，取3 ml菌液接種到產孢培養基，置于28 ℃培養箱中培養1個月后用0.05%（w）Twain-80水溶液清洗長有真菌的玉米粒，將清洗過糧食的吐溫用兩層紗布過濾，得到含有孢子的過濾液，稀釋濃度至5×105個/ ml。

1.4 試驗動物

用左旋咪唑，對三月齡綿羊進行驅蟲，21 d后，直腸取糞進行蟲卵檢查，以判斷體內寄生蟲是否驅除干凈。如檢查合格，使用注射器，將已準備好的8 000條捻轉血矛線蟲的三期幼蟲灌入綿羊胃內，21 d后收集糞便，再次進行蟲卵檢查，以確認線蟲是否接種成功。收集糞便于白瓷盤中弄碎，置于25 ℃培養箱培養7 d，期間定期攪拌并保持濕度，7 d后將攪拌均勻的糞便頂置于白瓷盤的蓋子上，第二天將蓋子上的蟲液用蒸餾水沖下，收集于燒杯中，然后通過貝爾曼法將蟲液中的糞渣除去，最后收集于細胞瓶中備用。

1.5 體內試驗

將一定濃度的孢子液給綿羊灌服，灌服后套上糞袋收集糞便，將真菌灌服后24 h內收集的糞便記為t1，48 h后收集的糞便記為t2，7 d后收集的糞便記為t3，根據Cai等[9]的工作顯示真菌在灌服120 h（±1）后孢子不太可能仍然存在，因此t1和t3采集的樣品能夠用作t2的樣品的未處理對照。這允許每只動物作為試驗的實驗單位。在每次取樣時，為每只動物的糞便培養物制備3個重復。

將每次收集的糞便搗碎后稱取10 g放入小平皿，加入少量水進行攪拌，將小平皿放入大平皿中，在大平皿中加入適量的水以保持濕度，最后放入26 ℃溫箱培養兩周，期間每隔三天進行一次攪拌并添加適量水分保持濕度，兩周后進行幼蟲計數。

通過貝爾曼漏斗法分離幼蟲，并按Cai等[9]的方法計算L3百分減少率。

1.6 數據統計分析

計算公式中每組均有三個平行組，t1和t3作為對照組，t2則為實驗組，從而計算出體內殺蟲率。然后通過spss軟件對幼蟲減少率使用t檢驗顯著性方差分析。

2 結果

從表1中可以看出灌服F35的糞便不同時期的糞便中L3數量差距均較大，而另外兩株菌的不同時期糞便中L3差距不是很明顯，尤其是F79三個時期差距都不大。

圖1顯示了3株A. oligospora對綿羊胃腸消化道線蟲捻轉血矛線蟲L3的捕殺效果。結果顯示，有2株少孢節叢孢菌株（F88，F79）在灌服后可以通過綿羊消化道，并對L3的捕殺效果差異顯著，一株（F35）不顯著，通過綿羊消化道后對糞便中三期幼蟲的捕殺率分別為46.00%, 99.47%, 17.84%。

圖1 三株少孢節叢孢通過綿羊消化道后對糞便中L3的捕殺率

3 討論

本試驗通過對3株A. oligospora通過綿羊消化道能力的試驗，結果表明，F88和F79的兩個分離株對綿羊體內三期幼蟲的捕食能力較弱，均低于50%，其中F79可以判定為無效，而F35使三期幼蟲的發育減少了99.47%，具有顯著的殺蟲效果。在不考慮灌服不準確等人為誤差外，分析其可能的原因與菌株自身差異有關，根據之前對A. oligospora體內外殺蟲實驗的報道[9]，該菌通過綿羊消化道的能力與D. flagrans相比很不穩定，不同地理分布的菌株的少孢節叢孢通過消化道的能力不同，而生存能力強的少孢節叢孢在通過綿羊消化道后仍能保持較強的捕食能力，明顯的減少L3的發育。此外，根據一些研究報道[9,10]，不同生長階段的A. oligospora對不良環境的抵抗力存在差距，A. oligospora的營養菌絲對動物消化道的耐受力不如分生孢子強，故所灌服A. oligospora分離株產孢能力的大小也會對試驗結果造成一定的影響。

通過分離株通過動物消化道的篩選實驗，A. oligospora的一些菌株具有通過綿羊消化道的能力，其中個別菌株還能保持較高的捕食效果，這也證實了捕食線蟲性真菌A. oligospora在臨床應用方面的價值和發展潛力，尤其是對消化道有較強耐受力的菌株，有望成為一種潛在的飼料添加劑應用到實際生物防治中。

表1 三株少孢節叢孢通過綿羊消化道后從糞便中獲得的L3數量