真空冷凍干燥對食線蟲真菌谷粒培養物含水量的影響

孫雨琪，羅千慧，侯俊達，岑曼益，趙睿明，霍生東

（西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

消化道蠕蟲感染已經對不同的藥物產生了廣泛的抗藥性，這導致了迫切需要新的技術用于預防和控制家畜的寄生蟲病。在新的抗蠕蟲藥的研發上必須要滿足以下要求：使用這些藥物要對人類和野生動物不產生毒性或毒性較低，對環境產生的影響要小，在畜產品中殘留物少。在應用這些藥物時為了達到預期的效果，用于控制反芻動物消化道蠕蟲感染的新方法已經在進行中，即將重點放在利用食線蟲真菌控制線蟲的替代策略上[1-4]。通過利用食線蟲真菌對線蟲的生物拮抗來防治動物寄生線蟲倍受關注，食線蟲真菌它成為一類首要的控制有害動物線蟲的生物因子,在整個動物控制線蟲的一個非常重要的位置，是一種寶貴的資源，還沒有被充分認識和利用。國內對這方面的研究還比較少[5,6],國外利用食線蟲真菌防治動物線蟲病已取得了一些進展[7-10]。

本研究的目的是探索食線蟲真菌Duddingtonia flagrans當地分離株在谷粒培養基中培養后，在真空冷凍干燥箱中冷凍干燥不同時間對含有D. flagrans分離株（SDH035）的培養物中水分含量的影響，為將來該菌株應用于家養動物寄生線蟲生物防治制劑的研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 菌種

食線蟲真菌D. flagrans分離株（SDH035），由西北民族大學蔡葵蒸教授課題組提供，菌株在4 ℃下2%玉米粉瓊脂斜面培養基保存。

1.2 培養基及其制備

水瓊脂培養基（WA）：按照1.5%～2%濃度稱取瓊脂粉于三角燒瓶中，加入蒸餾水，121 ℃高壓滅菌20 min，在超凈工作臺內完成倒制平板培養基，置于4 ℃保存備用。

2%麩皮浸出液：稱量20 g麩皮，量取1000 ml蒸餾水，加熱保持微沸狀態1 h，經6層紗布過濾后，置于2 000 mL量筒內，并補足至1 000 ml，采用保鮮膜封口置于4 ℃冰箱靜置過夜，吸取上清液，置于4 ℃保存備用。

2%麩皮瓊脂培養基（WBA）：在浸出液的基礎上再加入1.5 %～2 %的瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌20 min，在超凈工作臺內完成倒制平板培養基。

谷粒聯合培養基：糧食培養基的總重量為120 g，主要成分是玉米和小麥，其比例是2：1，按照比例稱取小麥和玉米放入500 ml錐形瓶中，再加入0.1%的 KH2PO4、0.05%的 MgSO4以及適量的蒸餾水使得糧食與蒸餾水的比例是1.5：1，用硅膠塞蓋住并用牛皮紙將其瓶口包好，121 ℃高壓滅菌30 min，置于4 ℃保存備用。

1.3 儀器設備

超凈工作臺；恒溫培養箱；恒溫振蕩培養箱（HZP—250 型）；光學顯微鏡（Leica DME 型）；倒置顯微鏡（Leica）；解剖針；錐形瓶；燒杯；研缽；漩渦振蕩儀；高速離心機；真空冷凍干燥箱等。

1.4 厚垣孢子的生產

在超凈工作臺內，用2%玉米粉瓊脂斜面培養基保存的菌株，在無菌環境下挑取少量菌絲，接種于WA平板中，置于28 ℃培養箱中培養6 d結束培養。用滅菌過的打孔器切取4 mm×4 mm大小含有菌絲的瓊脂塊，置于2% 液體培養基中，每瓶8塊，置于振蕩培養箱中，180 r/ min，相對濕度設為85%，28 ℃培養7 d后終止培養。上述培養物置于旋渦震蕩儀中反復振蕩10 min，按5%接種量將菌液接種至產孢培養基內，置于恒溫培養箱中，28 ℃培養25 d。終止培養。

1.5 谷粒培養物水分含量的測定

稱取1.4中獲得的含有真菌的谷粒培養物，記錄其質量，根據公式計算出不同冷凍干燥時間點平皿的質量，其谷粒培養物中水分含量計算公式如下：

2 結果

圖1顯示了食線蟲真菌D. flagrans分離株在真空冷凍干燥箱中分別冷凍干燥3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h后，含有厚垣孢子的谷粒培養物中的水分含量。結果顯示，隨著冷凍干燥時間的延長，谷粒聯合培養物中的水分含量逐漸降低，分別為8.26%、41.26%、38.16%、35.18%、30.49%、25.49%、21.06%和18.26%。

圖2顯示了上述含有食線蟲真菌厚垣孢子的谷粒聯合培養物在真空冷凍干燥箱中經過不同時間點的冷凍干燥后，冷凍干燥時間與谷物水分含量之間的關系。由圖2可知，真空冷凍干燥時間與谷粒含水量之間呈線性相關，隨著真空冷凍干燥時間的延長，谷粒中的水分含量逐漸降低，其R2為0.992，其線性回歸方程為：y=-4.2143x+59.675。

圖1 真空冷凍干燥后谷粒培養物中水分含量測定

3 討論

圖2 真空冷凍干燥時間與谷粒含水量之間的線性回歸分析

本研究通過對食線蟲真菌D. flagrans分離株在真空冷凍干燥箱中分別冷凍干燥3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h后，含有厚垣孢子的谷粒培養物中的水分含量。結果證明隨著冷凍干燥時間的延長，谷粒聯合培養物中的水分含量逐漸降低，分別為8.26%、41.26%、38.16%、35.18%、30.49%、25.49%、21.06%和18.26%，且真空冷凍干燥時間與谷粒含水量之間呈線性相關，隨著真空冷凍干燥時間的延長，谷粒中的水分含量逐漸降低，其R2為0.992，其線性回歸方程為：y=-4.2143x+59.675。說明該含有食線蟲真菌D. flagrans分離株的谷粒培養物在真空冷凍干燥的過程中，谷粒含水量受冷凍干燥的時間所影響，其中干燥時間越長，谷粒含水量就越低。因此，本研究提示在培養食線蟲真菌D. flagrans的過程中，環境中的濕度將會直接影響培養物中的含水量，這一結果將可能導致培養后期產孢量的變化。