Klotho蛋白對缺血再灌注急性腎損傷中Bax、Bcl-2、p62及LC3蛋白表達的影響

董麗娜，趙曄，于磊，劉國平，劉艾芹

急性腎損傷(AKI)是臨床常見的一種綜合征，主要表現(xiàn)為急性腎功能減退，其病情兇險、發(fā)病率及預(yù)后差，可進展為慢性腎臟病[1-2]。目前對AKI尚無完全有效的治療方法，因此早期診斷并采取有效治療措施對改善患者預(yù)后有著重要意義[3]。AKI的病理及生理變化非常復(fù)雜，其分子機制目前尚未完全清楚，積極探索AKI的分子作用機制利于發(fā)現(xiàn)新的治療方式[4]。缺血再灌注是AKI 最常見的病因，本研究通過小鼠缺血再灌注造模AKI，可有效探討其分子作用機制。Klotho 是一種抗衰老基因，可作為反映早期腎損傷標志物，并可成為早期診斷 AKI 的依據(jù)，成為其治療靶點[5]。本研究通過缺血再灌注急性腎損傷小鼠給予Klotho蛋白干預(yù)，分析其對Bax、Bcl-2、p62以及LC3蛋白表達的影響，以期為AKI的治療提供新的思路，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：雄性健康小鼠60只，8周齡，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實驗動物中心，飼養(yǎng)于清潔級實驗室中。(2)試劑：兔抗小鼠 p62抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體及LC3抗體均購自上海研謹生物科技有限公司；Western-blot及凝膠電泳試劑均購自南京凱基生物有限公司；重組可溶性 Klotho蛋白購自美國R&D公司。(3)儀器設(shè)備：切片機(OPJ-1B型，天津天利航空機電有限公司生產(chǎn))、離心機(TG16型，上海盧湘儀離心機儀器有限公司生產(chǎn))、恒溫箱(SHHW21.420型，北京永光明儀器有限公司生產(chǎn))、顯微鏡(Olympus IX71型，日本OLYMPUS生產(chǎn))、全自動生化分析儀(AU5800型,日本OLYMPUS生產(chǎn))、電泳儀(Bio-RaD型，美國Bio-Rad公司生產(chǎn))。

1.2 模型制備 2017年6月—2018年9月在內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院動物實驗室進行實驗，健康小鼠60只隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)、腎臟缺血再灌注組(I/R組)和Klotho蛋白組各20只。 I/R組：1%戊巴比妥鈉小鼠腹腔注射麻醉后，消毒鋪布，沿腹正中線剪開并鈍性分離暴露腎臟，采用小動脈夾對雙側(cè)腎蒂進行夾閉，腎臟顏色變暗紅后計時35 min，35 min后將動脈夾移除，觀察1 min內(nèi)腎臟顏色漸變?yōu)轷r紅，確定腎臟恢復(fù)灌注，縫合腹腔，進籠飼養(yǎng)。Sham組：小鼠同I/R組麻醉后，打開腹腔僅定位雙側(cè)腎蒂，但不夾閉，暴露腎臟35 min后，縫合腹腔入代謝籠飼養(yǎng)。Klotho蛋白組：手術(shù)方法同I/R組，手術(shù)時和術(shù)后2 h后在腹腔注射重組可溶性 Klotho 蛋白360 ng 1次。

1.3 觀察指標與方法 手術(shù)24 h后收集各組小鼠血液和腎組織標本待測。

1.3.1 腎組織形態(tài)學(xué)觀察：小鼠處死后，取腎臟組織并切成標本2塊，經(jīng)0.3 %戊二醛和1 %四氧化鋨固定，梯度丙酮脫水后石蠟包埋、切片(厚度5 μm)，HE染色，鏡下觀察染色情況及組織輪廓。

1.3.2 腎功能檢測： 小鼠麻醉后心臟穿刺取血，離心取上清液，全自動生化分析儀檢測血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)水平。

1.3.3 腎組織Bax、Bcl-2、p62及LC3蛋白表達：(1)采用改良異硫氰酸胍法提取小鼠腎組織總蛋白，-70℃下凍存；(2)將總蛋白40 μg溶入等體積的緩沖液中煮沸10 min，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離；(3)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜(NC膜)上；(4)NC膜置入封閉液中振蕩封閉30 min，漂洗3次后加入一抗(Bcl-2、Bax、LC3及GAPDH抗體均為1∶1 000稀釋， p62抗體為1∶500稀釋)孵育，4℃下過夜。二抗孵育2 h，用免疫熒光增強法顯色，采用Western-blot法檢測腎組織Bax、Bcl-2、p62及LC3蛋白的表達(以GAPDH的灰度比值表示)[6]。

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠腎組織形態(tài)變化 Sham組小鼠腎小管結(jié)構(gòu)清晰完整； I/R組腎組織損傷嚴重，腎小管上皮細胞刷狀緣丟失、變性壞死，部分腎小管的管腔擴張，腎間質(zhì)可見炎性細胞浸潤；Klotho蛋白組小鼠腎小管損傷明顯減輕，但部分小管仍有空泡變性(圖1見封3)。

2.2 3組小鼠腎功能比較 與Sham組比較，I/R組和Klotho蛋白組SCr、BUN水平明顯升高；與I/R組比較，Klotho蛋白組SCr、BUN水平降低 (P均<0.01)，見表1。

表1 3組小鼠腎功能比較

2.3 3組小鼠腎組織Bax、Bcl-2、p62及LC3蛋白表達比較 與 Sham組比較，I/R組及Klotho蛋白組Bcl-2和p62蛋白降低，Bax蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高；與I/R組比較，Klotho蛋白組p62和Bcl-2蛋白升高，Bax蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低(P均<0.01)，見表2。

3 討 論

AKI是臨床常見的以腎小球濾過率下降為特征的臨床綜合征[7]。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球范圍內(nèi)每年因AKI而死亡的人數(shù)可到200萬，在歐美國家AKI在入院患者中占3.2%～9.6%，其中1/5的入院患者死亡原因為AKI，甚至可占到ICU死亡患者的一半[8]。AKI的發(fā)病可受多種因素影響，包括肝衰竭、高血壓、心力衰竭、敗血癥、血容量減少、藥物及造影劑的使用等[9-10]。AKI是影響腎臟長期預(yù)后的獨立危險因素，對AKI早期診斷及積極有效干預(yù)，有望改善其預(yù)后[11]。I/R是 AKI最常見的病因，缺血缺氧會增加血管通透性、激活縮血管物質(zhì)并使血管促凝反應(yīng)降低，對血管造成損傷并產(chǎn)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生細胞毒性作用[12]。同時分泌大量黏附分子，與白細胞相互作用促進炎性介質(zhì)的分泌，導(dǎo)致炎性細胞浸潤腎組織，最終導(dǎo)致AKI[13]。目前I/R的分子機制研究已成為臨床治療AKI的熱點[14-17]。

表2 3組小鼠腎組織相關(guān)蛋白表達水平比較

Klotho是一種抗衰老基因，有研究表明，Klotho 蛋白在I/R導(dǎo)致的AKI中起著重要作用[18]。I/R會產(chǎn)生大量的羥自由基、超氧自由基及過氧化氫等，超出抗氧化酶的清除能力，從而使腎組織產(chǎn)生明顯的損傷[19-20]。本結(jié)果顯示，I/R組腎小管刷狀緣丟失，腎間質(zhì)被炎性細胞浸潤，腎組織損傷嚴重，腎小管上皮細胞刷狀緣丟失、變性壞死，部分腎小管的管腔擴張，而通過補充Klotho蛋白可減輕腎小管的損傷，緩解腎小管壞死。本結(jié)果顯示，Klotho蛋白組SCr、BUN水平明顯低于I/R組(P<0.05)，這說明I/R組小鼠腎功能受損嚴重，Klotho 蛋白會促進MEK/ERK 通路磷酸化，使腎組織細胞凋亡明顯減少，同時其具有抗氧化應(yīng)激及抗炎性反應(yīng)作用，可促進腎組織修復(fù)，盡快恢復(fù)腎功能[21]。

AKI過程中伴隨著細胞死亡，而細胞死亡的3種常見表現(xiàn)為壞死、凋亡及自噬[22]。自噬是一種機體防御機制，是細胞胞漿內(nèi)容物被包裹運送到溶酶體降解和再利用的一種代謝過程，其在AKI發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[23]。大量研究證實自噬在肺病、神經(jīng)退行性疾病及腎臟病等中起到重要作用[24]。受到缺血、缺氧、感染及藥物等影響，自噬水平會上調(diào)[25]。本研究結(jié)果顯示，Klotho蛋白組p62明顯高于I/R組，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯低于I/R組(P<0.01)，表明了I/R小鼠的自噬水平明顯增高，這是因為自噬水平增高會伴隨LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)換及p62的降解，而自噬體形成時LC3-Ⅰ蛋白可與磷脂酰乙醇胺相結(jié)合，從而形成LC3-Ⅱ蛋白；p62蛋白會選擇性與LC3-Ⅱ結(jié)合，并被自噬體降解，所以I/R小鼠表現(xiàn)為LC3-Ⅱ升高和p62降低[26-27]。I/R損傷后會激活系列凋亡通路，其中促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2會對腎細胞的凋亡起到重要作用[28]。本結(jié)果顯示，Klotho蛋白組Bcl-2蛋白明顯高于I/R組，Bax蛋白表達明顯低于I/R組(P<0.05)，這是因為Klotho蛋白具有抗凋亡作用，補充 Klotho 蛋白可以明顯降低I/R小鼠的促凋亡蛋白Bax的表達水平，通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，增高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平，降低I/R損傷后細胞的早期凋亡率，從而使受損的腎小管上皮細胞盡快恢復(fù)。

綜上所述，Klotho蛋白可延緩腎細胞損傷，起到腎保護作用，可為AKI的治療提供新的作用靶點。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

董麗娜:論文撰寫,收集整理資料，分析數(shù)據(jù)，圖表設(shè)計，參考書籍查找；趙曄、劉艾芹：資料搜集整理；于磊、劉國平：修改總指導(dǎo)