烏梅提取物對特發性高鈣尿大鼠腎結石形成和腎功能的影響及作用機制

楊敏，李家兵，劉貴喜，孫懿，羅成君

腎結石是泌尿系統的常見疾病，按結石成分劃分，臨床上以草酸鈣結石最為常見，不僅會引起腎絞痛、血尿等癥狀，還會對腎功能產生影響[1-2]。目前，腎結石的發病機制仍未完全闡明，也缺乏有效的預防及藥物治療手段。烏梅由薔薇科植物梅的干燥成熟果實加工得到，富含檸檬酸、蘋果酸、丁二酸等有機酸成分，不僅能夠在結石形成過程中與鈣離子螯合、降低結石形成的風險，還能通過抗炎、抗氧化等方式發揮組織及細胞保護作用[3-4]。特發性高鈣尿大鼠的特征是血清鈣正常，但腎小管對鈣重吸收存在障礙并造成尿鈣增加，進而容易自發形成腎結石，是目前用于研究腎結石理想的動物模型。為了明確烏梅提取物對腎結石形成的預防和治療價值，本研究以特發性高鈣尿大鼠為實驗對象，具體分析了烏梅提取物對大鼠腎結石形成及腎功能的影響及機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：特發性高尿鈣大鼠24只及健康清潔級SD大鼠12只購自四川省人民醫院實驗動物研究所[許可證SYXK(川)2019-217]，均為雄性，體質量220～250 g，飼養環境22～26℃、濕度40%～60%，自由攝食飲水。(2)試驗試劑：烏梅提取物購自Sigma公司，炎性細胞因子及8-羥基脫氧鳥苷(8-OHDG)的酶聯免疫吸附檢測試劑盒購自上海酶聯公司，丙二醛(MDA)的硫代巴比妥酸檢測試劑盒及總抗氧化力(T-AOC)的比色法試劑盒購自南京建成研究所，基因mRNA表達檢測試劑盒購自北京天根公司。(3)儀器設備：全自動生化分析儀為美國愛德士公司生產，型號Catalyst Dx。顯微鏡為Nikon公司生產，型號E200。超聲儀為VisualSonics公司生產，型號Vevo。

1.2 實驗方法 2018年1—12月于西南醫科大學臨床醫學院中心實驗室進行實驗。健康清潔級SD大鼠12只作為對照組， 特發性高尿鈣大鼠24只按隨機數字表法分為模型組12只和干預組12只。模型組大鼠常規飼養，給予生理鹽水2 ml灌胃，1次/ d，連續28 d；干預組給予0.15 g/ml 烏梅提取物溶液2 ml灌胃，1次/ d，連續干預28 d。

1.3 觀察指標與方法 干預28 d后處死大鼠，留取血液標本10 ml，離心得血清在-80℃保存。大鼠開腹后解剖腎臟，等分為2份，1份用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，蠟塊在陰涼處保存；另1份用液氮冷凍后在-80℃冰箱保存。

1.3.1 腎功能測定：取-80℃保存的血清標本，采用全自動生化分析儀測定血肌酐(SCr)及尿素氮(BUN)含量。

1.3.2 草酸鈣結晶量評分[3]：取石蠟包埋的腎臟組織，制作石蠟切片后進行HE染色，在顯微鏡下觀察每個高倍視野下草酸鈣結晶的數量。視野內無結石、結晶為1分，結石、結晶<3個為2分，結石、結晶3～5個為3分，結石、結晶6～10個為4分，結石、結晶>10個為5分。

1.3.3 炎性因子及氧化應激指標測定：取液氮冷凍的腎臟組織適量，加入磷酸鹽緩沖液后對組織進行超聲勻漿， 離心取上層澄清液體后采用酶聯免疫吸附試劑盒測定白介素-1β(IL-1β)、高遷移率族蛋白B1(HMGB-1)、趨化因子配體2(CCL-2)、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、8-OHDG的含量，采用硫代巴比妥酸法試劑盒測定MDA含量，采用比色法試劑盒測定T-AOC含量。

1.3.4 BMP2通路基因測定[5]：取石蠟包埋的腎臟組織，采用石蠟包埋組織切片總RNA提取試劑盒提取組織總RNA，采用FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，采用Talent熒光定量檢測試劑盒對cDNA進行熒光定量PCR擴增，所用引物分別為BMP2、MSX2、RUNX2、Osx的特異性引物，根據擴增后儀器上顯示的擴增曲線計算基因的mRNA表達水平。

2 結 果

2.1 3組腎功能指標及草酸鈣結晶量評分比較 SCr、BUN含量及腎臟組織草酸鈣結晶量評分比較，模型組大鼠高于對照組，而干預組大鼠低于模型組(P均<0.01)，見表1。

2.2 3組腎組織炎性細胞因子比較 腎臟組織IL-1β、HMGB-1、CCL-2、MCP-1含量比較，模型組大鼠明顯高于對照組，而干預組低于模型組(P均<0.01)，見表2。

2.3 3組腎組織氧化應激指標比較 模型組大鼠腎臟組織MDA、8-OHDG的含量明顯高于對照組，T-AOC含量低于對照組；而干預組大鼠腎臟組織MDA、8-OHDG的含量低于模型組，T-AOC的含量高于模型組 (P均<0.01)，見表3。

2.4 3組腎組織BMP2通路基因表達比較 大鼠腎臟組織BMP2、MSX2、RUNX2、Osx的mRNA表達水平比較，模型組明顯高于對照組，干預組低于模型組(P均<0.01)，見表4。

3 討 論

草酸鈣結石是最常見的腎結石類型，鈣鹽過飽和沉積是腎結石形成的重要病理生理基礎，特發性高尿鈣大鼠腎小管對鈣的重吸收存在障礙、尿鈣明顯增加，容易在腎臟內出現鈣鹽過飽和并出現結石，因而特發性高尿鈣大鼠也是研究腎結石常用的動物模型[6]。本研究以特發性高尿鈣大鼠作為模型組，通過觀察腎臟組織中草酸鈣結晶數量及血清中腎功能指標的變化可知，模型組大鼠腎臟組織中草酸鈣結晶量評分及SCr、BUN含量明顯高于對照組，提示特發性高尿鈣大鼠腎臟內大量草酸鈣結晶、結石形成且腎功能發生了一定損害，血液中SCr及BUN含量升高。

表1 3組大鼠血清腎功能指標及腎臟組織中草酸鈣結晶量評分比較

表2 3組大鼠腎臟組織炎性細胞因子比較

表3 3組大鼠腎臟組織氧化應激指標比較

表4 3組大鼠腎臟組織BMP2通路基因表達比較

目前臨床上腎結石尚缺乏有效的藥物治療或預防手段，主要采用體外震波碎石、經皮腎鏡取石等外科手段進行治療。烏梅提取物通過有機酸的協同作用來螯合鈣離子、抑制草酸鈣結晶形成、防止鈣鹽飽和析出、預防結石形成。本研究使用烏梅提取物來對特發性高尿鈣大鼠腎結石進行預防和治療，結果表明，干預組大鼠腎臟組織中草酸鈣結晶量評分及SCr、BUN含量明顯低于模型組，提示烏梅提取物對特發性高尿鈣大鼠的腎結石形成具有抑制作用，同時也能改善因結石沉積所引起的腎功能損害。

草酸鈣結晶及結石在腎臟內的聚集會持續刺激腎小球內皮細胞和系膜細胞、腎小管上皮細胞，使細胞內的炎性反應、氧化應激反應發生激活，進而引起腎功能發生損害[7-9]。IL-1β、HMGB-1、CCL-2、MCP-1等炎性細胞因子的大量釋放是炎性反應激活的特征，IL-1β、HMGB-1具有促炎活性，能夠介導炎性的級聯放大，CCL-2、MCP-1具有趨化活性、能夠介導炎性細胞在腎結石周圍組織的浸潤[10-12]。氧自由基的大量生成是氧化應激激活的特征，通過引起局部組織結構的氧化損傷來導致腎功能異常，同時伴有氧化產物MDA、8-OHDG生成增多及抗氧化指標T-AOC的下降[13-14]。本研究對上述炎性反應及氧化應激指標的分析顯示：模型組大鼠腎臟組織中IL-1β、HMGB-1、CCL-2、MCP-1、MDA、8-OHDG的含量明顯高于對照組，T-AOC的含量明顯低于對照組；而干預組大鼠腎臟組織中IL-1β、HMGB-1、CCL-2、MCP-1、MDA、8-OHDG的含量明顯低于模型組，T-AOC的含量明顯高于模型組，提示特發性高尿鈣大鼠的腎臟組織中炎性反應及氧化應激反應過度激活，烏梅提取物則能顯著抑制炎性反應及氧化應激反應。

腎臟局部草酸鈣結石或結晶的持續刺激是引起炎性反應及氧化應激反應激活的重要因素，而BMP2信號通路在組織鈣化、礦化中起到重要作用。白栩搏[15]的動物研究證實，BMP2信號通路的過度激活參與了特發性高尿鈣大鼠腎結石的形成。本研究對特發性高尿鈣大鼠腎臟內BMP2通路基因表達的分析顯示：模型組大鼠腎臟組織中BMP2、MSX2、RUNX2、Osx的mRNA表達水平明顯高于對照組。這一結果與白栩搏[15]的研究一致，表明BMP2信號通路的過度激活與特發性高尿鈣大鼠腎結石的形成密切相關。MSX2、RUNX2是BMP2下游重要的轉錄因子，通過靶向啟動Osx的表達來參與骨形成、組織鈣化的調控。在烏梅提取物干預后觀察到，干預組大鼠腎臟組織中BMP2、MSX2、RUNX2、Osx的mRNA表達水平明顯低于模型組，提示烏梅提取物對特發性高尿鈣大鼠腎臟中BMP2通路的激活具有抑制作用。

綜上所述，烏梅提取物對特發性高鈣尿大鼠腎結石形成及腎功能均具有改善作用，同時也能抑制腎臟組織中炎性反應、氧化應激反應及BMP2通路的激活，這也可能是烏梅提取物改善腎結石形成及腎功能的相關分子機制。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

楊敏：負責實驗設計、整體實施及論文寫作；李家兵：負責實驗指導及論文審校；劉貴喜：負責動物的干預及取材；孫懿、羅成君：負責指標檢測和數據錄入