不同磷濃度條件下地表球囊霉對黃瓜枯萎病抗性和抗氧化酶活性的影響

王倡憲 王艷 張志

摘要：試驗采用盆缽培養的方法于黃瓜育苗時接種地表球囊霉（G. versiforme），并分別澆灌磷濃度為0、31、93 mg/kg 的營養液，于苗齡為4周時，采用灌根法接種尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp.）分生孢子懸液，以明確不同磷濃度條件下G. versiforme對黃瓜幼苗枯萎病的防效及相關酶活性的影響。結果表明，磷濃度為31 mg/kg時，G. versiforme可明顯提高黃瓜幼苗對枯萎病的抗性，接種病原菌后9 d時，菌根化幼苗的病情指數較相應對照降低10百分點;同時，接種G.versiforme的幼苗葉片中蔗糖含量為其相應對照的1.4倍。幼苗接種病原菌后，與各自相應的對照相比，接種G.versiforme處理葉片中多酚氧化酶（PPO）活性較高，過氧化物酶（POD）活性相對穩定，且峰值出現時間較晚。

關鍵詞：黃瓜;地表球囊霉;磷濃度;枯萎病;抗病性;抗氧化酶

中圖分類號： S436.421.1+3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0129-03

收稿日期：2018-08-03

基金項目：黑龍江省教育廳科學技術研究項目（編號：12511403）。

作者簡介：王倡憲（1974—），女，內蒙古包頭人，博士，副教授，主要從事植物根際營養的教學與科研工作。E-mail：wangcxsz08@163.com。

黃瓜（Cucumis sativus L.）作為我國主要栽培蔬菜種類之一，近年來，種植面積和產量均呈現增加趨勢，與此同時，土傳病害逐年加重是黃瓜栽培過程中存在的一個古老而又現實的問題[1-3]。其中，由尖孢鐮刀菌黃瓜專化型（Fusarium xysporum f.sp.cucumerinum）病原菌引起的枯萎病易發難防，危害嚴重，目前，該病以化學農藥防治為主，而由此引起的瓜果質量下降與環境污染問題已成為人們日益關注的焦點[4]。

隸屬于球囊霉門的叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌廣泛分布于農業生態系統中，該類真菌可以和包括黃瓜在內的約90%維管植物形成菌根共生體，互惠型共生體建成后，AM真菌對寄主的生長發育及抗逆性的提高均表現出積極效應[5-6]。近年來，有關AM真菌對黃瓜枯萎病防效及其機制的研究陸續展開，但是，結果卻不盡相同，主要是由于AM真菌的防效與AM真菌種類、寄主、土壤環境等諸多因素有關，其中，介質中的磷水平是影響共生體發育的最根本因素[7-13]。鑒于此，本試驗探索不同磷濃度條件下AM真菌對黃瓜枯萎病的抗性及不同處理下黃瓜葉片中與抗性相關酶活性的變化，以明確AM真菌對黃瓜枯萎病的防效及適宜磷濃度，并為深入研究相關機制奠定理論基礎。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

黃瓜：津綠3號，由天津科潤黃瓜研究所提供。播種前將充分吸水的種子在10% H2O2中浸泡10 min進行表面消毒，然后用蒸餾水洗凈藥液，在55 ℃條件下水浴浸種，浸種時不斷攪拌，持續20 min，使種子吸水膨脹，供給種子萌發所需基本水量，并起到種子表面消毒的作用，取出后于28 ℃恒溫箱中黑暗催芽。

育苗基質及容器：將滅菌的草炭與蛭石以1 ∶1的體積比混合均勻。營養缽（上口徑8.5 cm，底徑6.0 cm，高7.5 cm）用福爾馬林密封1周進行消毒處理，待氣味散盡后備用。

AM菌劑：以玉米為寄主，以草炭為基質擴繁2個月，混合接種劑中含有地表球囊霉（G.versiforme，縮寫為G.v）真菌的孢子、菌絲和被侵染根段。

病原菌（Fusarium oxysporum f.sp.，略寫為F.o，由中國農業科學院植物保護研究所提供）孢子懸液：先將病原菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基上25 ℃黑暗培養3 d，然后從菌落邊緣挑取2塊直徑為3～4 mm的菌塊于滅菌的馬鈴薯-葡萄糖培養液中28 ℃、50 r/min培養2周，用消毒的雙層紗布濾掉菌絲，將剩余的培養液于4 ℃、9 000 r/min 下離心3次，收集孢子懸液，用血球板計數，最后用10 mmol/L MgSO4·7H2O調節孢子濃度至5×104 CFU/mL。病原菌孢子懸液制備過程中的所有器皿及制備后的病原菌殘余物均須滅菌處理。

1.2?試驗設計

本試驗共設6個處理。AM真菌：接種G.v（M）、不接種G.v的對照（NM）;磷水平：P0（0 mg/kg）、P1（31 mg/kg）、P2（93 mg/kg）。

6個處理分別表示為：（1）MP0;（2）MP1;（3）MP2;（4）NMP0;（5）NMP1;（6）NMP2。每處理設15次重復。磷以Ca（H2PO4）2·H2O的形式加入Hoagland營養液中，調節營養液pH值為6.5。

1.3?試驗實施

試驗采用生物模擬培養的方法于人工氣候室進行。每盆裝基質90 g，播種2粒黃瓜種子，出苗后留1株，其中接種AM真菌處理將菌劑與基質混勻裝盆，每盆菌劑用量為10 g，不接種的對照加入等量的滅菌菌劑和10 mL菌種濾液，以保證其他微生物的種類一致。從播種開始，1周后出苗，第2周開始隔日澆灌1/4強度不同P濃度營養液，第3周真葉展開，澆灌1/2強度不同磷濃度的營養液。出苗4周后采用灌根法接種病原菌，每盆接種20 mL病原菌孢子懸液，接種后即停止澆灌營養液。

1.4?分析測定

分別于接種病原菌后1、3、5、7、9 d隨機取3株黃瓜幼苗進行葉片中多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）活性測定，同時取根樣調查根系發病情況，最后1次取樣測定植株生物量并計算病情指數;植株葉片全氮、全磷含量用FIA分析儀測定;菌根侵染率用網格交叉法測定[14];PPO活性采用兒茶酚比色法、POD活性采用愈創木酚比色法[15]測定。

2?結果與分析

2.1?不同磷濃度條件下，AM真菌對植株生長及抗病性的影響

從表1可以看出，植株長勢及生物量隨介質中磷濃度的增加而增加，并且以磷濃度為93 mg/kg時植株生物量最高。3種磷濃度條件下，只有無磷處理條件下接種AM真菌的植株生物量顯著高于其相應的對照，磷濃度為31、93 mg/kg 時，接種AM真菌幼苗的生物量與其各自相應對照間差異均未達到顯著水平，表明在無磷營養脅迫條件下，AM真菌具有顯著的促生效應，隨著介質中磷濃度的升高，AM真菌的促生效應降低。蔗糖作為植株體內光合作用的主要運輸產物，它在植株葉片中含量的高低間接反映了植株體內的能量儲備狀況及植株根系可獲得能量物質的潛力。3種磷濃度條件下，接種AM真菌處理植株葉片中蔗糖含量與各自相應的對照間均無顯著差異，磷濃度為31 mg/kg 時，接種AM真菌的幼苗葉片中蔗糖含量顯著高于無磷條件的對照，該處理幼苗葉片中的蔗糖含量為其相應對照的1.4倍。接種病原菌后較高的磷濃度（93 mg/kg）下，G.V.依然可以侵染黃瓜幼苗根系，且菌根侵染率高達40.2%。高磷處理條件下植株葉片中蔗糖含量低于中等磷濃度處理可能是寄主中可利用碳源供給AM真菌所致。有研究認為，在足夠的磷供應條件下，如果菌根侵染率不因磷濃度升高而有所下降時，AM真菌會誘導光合產物從寄主轉運至AM真菌[16]。取樣調查根系發病情況時發現，無磷條件下，3 d取樣時，非菌根化植株即有10%的側根壞死，而接種AM真菌處理到接種后5 d才有零星的側根壞死，但到接種后9 d取樣時，2處理間的受害程度基本一樣嚴重，這主要是由無磷條件下植株長勢相對較弱，容易受到病原菌的侵害所致。在中等磷條件下，AM真菌的抗病效應較為明顯。而在高磷條件下，AM真菌對植株的抗病性基本無影響，這主要由于在該條件下，無論接種與否，植株生長相對較為健壯，不易感染病害。

2.2?不同磷濃度條件下，AM真菌對葉片中多酚氧化酶、過氧化物酶活性的影響

2.2.1?多酚氧化酶活性

不同磷濃度條件下，接種病原菌后植株葉片PPO活性變化見圖1，可以看出，在無磷處理條件下， 菌根化植株葉片中PPO活性在接種病原菌后3 d即達到第1個峰值，且顯著高于對照，到接種病原菌后的7 d出現第2個酶活性高峰，而不接種的對照到接種病原菌后的7 d才達到其僅有的一個峰值，接種后第3天和第7天此時的酶活分別為同時期對照酶活性的8.3倍和1.9倍。當營養液中磷水平上升為31 mg/kg 時，菌根化植株葉片中PPO活性的變化趨勢與其相應的對照基本一致，即到接種病原菌后7 d，葉片中PPO活性均達到僅有的一個峰值，但接種病原菌后一直以接種AM真菌處理PPO活性較高;當磷濃度增加至93 mg/kg 時，接種AM真菌處理葉片中PPO活性于接種病原菌后7 d達峰值，此時的酶活性為相應對照的3.4倍，盡管對照酶活性于接種病原菌后3 d就達到其僅有的一個峰值，但此時的酶活性與接種AM真菌處理的酶活性相等。

綜合上述接種病原菌后植株在不同磷濃度條件下葉片中PPO酶活性變化趨勢可以推斷，植株受到病原入侵時，菌根化植株對外源病原菌的侵入表現得更為敏感，而非菌根化植株的反應較為遲鈍。即在無磷條件下，接種病原菌后菌根化幼苗葉片中PPO活性較高且峰值出現得較早，而非菌根化植株體內PPO活性較低且峰值出現得較晚，且在3種磷濃度條件下，以無磷條件下菌根化植株對病原菌的侵入更為敏感，這可能是在低磷條件下菌根共生體的形成受到了影響所致。

2.2.2?過氧化物酶活性?在無磷處理條件下，接種病原菌后非菌根化植株葉片中POD活性變幅一直明顯大于菌根化處理（圖2），即對照POD活性于接種病原菌后3 d即達到峰值，此時的酶活性為菌根化處理的7.2倍，而菌根化植株葉片POD活性于接種病原菌后5 d達到其僅有的一個峰值。磷濃度為31 mg/kg 時，菌根化植株葉片POD活性于接種病原菌后7 d達到峰值，而不接種的對照比菌根化處理提前2 d 達到其峰值。當營養液中磷濃度增加至93 mg/kg時，接種AM真菌處理植株葉片POD活性于接種病原菌后9 d達到峰值，但此時的酶活性與相應的對照接近，而對照植株葉片POD活性較相應的菌根化處理提前4 d達到最大值，且此時的酶活性為菌根化處理的1.6倍。

在3種磷水平條件下，接種病原菌后，AM真菌對植株體內POD活性的影響具有相似的趨勢，結合植株的發病情況認為，植株受到病原侵襲時，其體內POD活性的變化在很大程度上是植株受害程度的一種體現。具體而言，與菌根化幼苗葉片幼苗葉片中相對穩定的POD活性相比，菌根化植株體內POD活性變幅較大，且酶活性峰值出現時間早。

早期在番茄上的研究首次證實，AM共生體的形成可誘導寄主產生系統抗性[17]。即植株在受到病原菌攻擊時，被感染的部位會通過一定的方式對病原菌的入侵做出反應，同時在未感染病原菌的部位也產生相類似的反應。因此，不同磷濃度條件下，接種病原菌后，植株葉片PPO、POD活性的變化在一定程度上反映了植株根系受到病原侵襲時所誘導的防御反應，且PPO、POD均與植株的抗病性有關，相關研究結果認為，當植株受到病原菌的侵害時，植株體內的PPO、POD活性均會升高，以增加其抗病性[18-20]。本研究中，在接種病原菌的條件下，AM真菌對植株體內PPO、POD活性的影響不同，其中，菌根化植株PPO活性峰值總體出現得較早且酶活性較高，而非菌根化植株體內PPO活性峰值出現得較晚且相對穩定較低;周寶蜊等研究發現，接種病原菌條件下，菌根真菌可顯著提高寄主PPO活性[21]。菌根化植株體內POD活性相對穩定，且酶活性峰值出現時間較晚，而非菌根化植株體內POD活性變幅較大，且酶活性峰值提早出現。接種病原菌后，當介質中無磷供給時，非菌根化幼苗葉片中POD活性的變化尤為明顯。這與已報道的相關研究結果[22]一致。

。

3?結論

在接種病原菌密度為5×104 CFU/mL的條件下，基質中磷濃度影響植株的抗病性。其中，磷濃度為31 mg/kg時，AM真菌的促生效應不明顯，但可明顯提高黃瓜幼苗對枯萎病的抗性。無磷條件下，AM真菌表現出顯著的促生效應，但因植株長勢較弱，抗病能力極低。高磷條件下，接種AM真菌可在一定程度上減輕病害。G. versiforme（G.v）在較高的磷濃度（93 mg/kg）條件下，其菌根侵染率仍高達40.2%，因此在黃瓜生產中可將其引入磷含量較高的土壤，提高植株的抗病性。植株受到病原入侵時，植株體內PPO活性的變化可作為植株受病原菌入侵后做出迅速反應的指標;而接種病原菌后植株葉片中POD活性的變化只是病癥表現的反映。

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