1株蠶沙高溫腐熟菌的篩選及應用

李秀玲　辛磊　安慧　覃勇榮

摘要：為尋找高效的高溫腐熟菌用于蠶沙的無害化處理，從蠶沙傾倒地篩選到1株菌株CP2，該菌株纖維素酶活性達到136.67 U/mL。將該菌株接種到蠶沙中進行堆肥試驗，通過檢測堆肥過程中堆體的溫度、含水率、pH值、有機質含量、全氮含量、碳氮比及種子發芽指數等指標評價菌株CP2的應用效果。結果表明，試驗組較對照組更能提高堆體溫度、延長高溫期、降低堆體含水量、促進有機質分解、降低碳氮比;試驗組種子發芽指數在腐熟25 d時已達到88%，高出對照組15百分點;以上結果說明，加入CP2菌株進行堆肥，可加快蠶沙腐熟并提高堆肥品質。

關鍵詞：蠶沙;纖維素降解菌;堆肥;高溫腐熟;CP2菌株

中圖分類號：S141.4;S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0314-04

收稿日期：2018-06-09

基金項目：河池學院碩士專業學位授予單位立項建設基金（編號：2016HJA006）。

作者簡介：李秀玲（1983—），女，山東泰安人，碩士，講師，主要從事固體廢棄物的資源化應用研究。E-mail：lixiuling0606@163.com。

通信作者：覃勇榮，博士，教授，主要從事石漠化生態修復研究。E-mail：1595677337@qq.com。

隨著我國新農村建設的速度日益加快，固體廢棄物的資源化利用受到高度重視[1]。農村固體廢棄物總體而言主要包括日常的生活垃圾、農林廢棄物及畜禽糞便等[2]，產生量大、成分復雜且含有有機物質。如果處理得當，這些物質會變成富含養分和有機質的優質肥源;如若處理不當，勢必會造成環境的二次污染[3]。

我國種桑養蠶歷史悠久，種植面積、養蠶數量及蠶絲出口量一直保持世界領先水平。蠶沙作為養蠶行業的主要副產物之一，產量巨大并含有豐富的氮、磷、鉀及微量元素和有機質[4]，是一種優質的有機源。蠶農多是將蠶沙以及病死蠶在不處理的情況下直接回施于桑園，代替有機肥使用，但蠶沙不僅隱藏有大量的病原菌，而且含有大量的難以降解的纖維素，不經處理會提高蠶病發生概率及嚴重程度，且會對桑園土質造成破壞，直接或間接給蠶農造成不可估量的損失，因此蠶沙的資源化利用一直被業界關注[5]。

我國“東桑西移”工程的實施，使廣西壯族自治區尤其是河池市宜州區的種桑養蠶數量保持數年全國第1，在2018年宜州區更是被我國蠶學會授予“中國蠶桑之鄉”稱號，因此宜州區每年養蠶所產生的蠶沙數量非常大，其中所存在的問題亟待解決。本研究從宜州區當地的蠶沙傾倒地采集樣品，從中分離出纖維素降解菌，經濾紙條降解試驗及產酶活性測定等研究，確定該菌株的纖維素酶活性，進一步通過研究堆體的溫度、碳氮比、發芽指數等確定該菌對蠶沙的腐熟應用效果，以期篩選到適合當地應用的菌株，為廣西蠶沙的綜合利用提供研究基礎。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?樣品

試驗樣品采自廣西壯族自治區河池市宜州區蠶沙傾倒地的腐殖土。

1.1.2?培養基

LB培養基：蛋白胨10 g，酵母浸出粉10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。羧甲基纖維素鈉（CMC）培養基：CMC-Na 15.0 g，NH4NO3 1.0 g，蛋白胨1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO4 1.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL。纖維素剛果紅培養基：K2HPO4 0.50 g，CMC-Na 2.00 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，明膠2.00 g，剛果紅0.20 g，瓊脂15.00 g，蒸餾水1 000 mL。赫奇遜培養液：KH2PO41.00 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，CaCl2 0.10 g，NaCl 0.10 g，FeCl30.01 g，NaNO3 2.50 g，pH值7.2～7.3，蒸餾水1 000 mL。

1.2?試驗方法

1.2.1?高溫纖維素降解菌的篩選?（1）初篩過程：取10 g樣品加入含有玻璃珠的90 mL無菌水中，采用漩渦振蕩器振蕩搖勻，取1 mL加入9 mL無菌水中，依次稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8個稀釋度，取10-6、10-7、10-8等3個稀釋度溶液各200 μL 涂布于CMC培養基上，每個梯度設3個重復，置60 ℃培養箱中培養，待菌落長出后挑取外形不同的單菌落劃線培養，備用。（2）復篩過程：將初篩菌株接種在纖維素剛果紅培養基上，每個菌株3個重復，置于培養箱中培養后，測量透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）的差值，初步判斷所篩選菌株降解纖維素的能力大小。

1.2.2?濾紙條降解試驗

將1 mL篩選得到的降解菌發酵液接種到裝有50 mL赫奇遜培養液的三角瓶中，瓶中放置1 cm×6 cm的新華Ⅰ號濾紙條，每個處理3個重復，設不加菌液的濾紙條作為對照，置于32 ℃ 180 r/min恒溫搖床上、振蕩培養5 d，觀察各瓶中濾紙條潰爛情況[5]。

1.2.3?纖維素酶活性測定

參照NY/T 1847—2010《微生物肥料生產菌株質量評價通用技術要求》[6]中規定的方法測定纖維素酶活性。在25 mL具塞試管中加入濾紙條、1 mL檸檬酸鹽緩沖液和2 mL DNS試劑處理后，用蒸餾水定容至25 mL，測定540 nm 下的吸光度，對照標準曲線計算酶活性，以蒸餾水代替發酵液為對照。在50 ℃、pH值為5.5條件下，以1 min內1 mL樣品降解濾紙產生1 μg葡糖糖為1個酶活性單位（IU）。

1.3?堆肥試驗

1.3.1?纖維素降解菌發酵液制備

將“1.2.1”節中篩選到的菌株接種到LB培養液中進行搖瓶培養，培養完畢后將該菌液混勻，采用平板涂布法計數，確保有效活菌數為1億個/mL，備用。

1.3.2?蠶沙堆肥處理

從宜州區當地的蠶農家收集蠶沙，分為試驗組和對照組，試驗組添加“1.3.1”節中制備的菌液，對照組添加同等量的無菌水，確保含水率為60%，每組設2個重復，每個重復50 kg蠶沙。添加菌液和無菌水后，將堆體混合均勻，置于河池學院溫室大棚中，并加蓋黑色塑料布，4 d翻堆1次，堆肥時間為2017年6月30日至7月29日，為期30 d。

1.3.3?溫度測定

以堆體中心處為測量點，每天10：00和17：00測定溫度，取平均值作為堆肥溫度，同時測定環境溫度。

1.3.4?蠶沙發酵前后理化指標測定

以堆體四周對稱的4個點為采樣點，采樣深度為20 cm，各點采樣50 g，混合后備用。對堆體腐熟前后的含水率、pH值、有機質含量、全氮含量等理化指標進行測定。堆體含水率測定采用常壓干燥法。pH值測定：將樣品與蒸餾水按1 ∶10（質量濃度）比例混合，配制成蠶沙懸濁液，室溫180 r/min振蕩1 h后靜置，用pH計測定上清液pH值。有機質含量的測定采用重鉻酸鉀-濃硫酸氧化比色法。全氮含量采用H2SO4-H2O2消煮、奈氏比色法測定[7]。

1.3.5?堆肥處理的種子發芽指數測定

參照黃國鋒等的方法[8]進行種子發芽指數測定。稱取不同腐熟時間的堆肥樣品10 g，加入蒸餾水100 mL，充分振蕩后過濾，吸取濾液10 mL 置于鋪有雙層濾紙的培養皿中，在濾紙上均勻擺放10粒白菜種子，置于25 ℃培養箱中培養48 h后，計算發芽率（GI），設置3次重復，對照為蒸餾水。種子發芽率的計算公式為GI=（堆肥浸提液處理的種子發芽率×堆肥浸提液處理的種子根長）/（蒸餾水處理的種子發芽率×蒸餾水處理的種子根長）×100%。

1.4?統計方法

試驗數據采用SPSS 20數據分析軟件進行統計分析。

2?結果與分析

2.1?高溫纖維素降解菌的篩選

經過初篩，共得到8株高溫纖維素降解菌，編號為CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6、CP7、CP8;將8株菌株進行復篩培養后，分別測量透明圈直徑和菌落直徑，計算平均值。結果表明，有5株菌株產生了透明圈，其中CP2產生的透明圈直徑最大，透明圈直徑與菌落直徑的差值也最大，數據如表1所示。統計分析表明，CP2菌株的透明圈直徑與其他菌株存在顯著性差異;而CP2菌株的菌落直徑除與CP8菌株不存在顯著性差異外，與其他菌株均存在顯著性差異。

2.2?濾紙條降解試驗

將篩選到的5株菌株進行濾紙條降解試驗，結果（表2）表明，CP2菌株對濾紙條的降解效果最好，濾紙條變為糊狀，其他4株菌株處理下的濾紙條均未達到糊狀。

2.3?纖維素酶活力測定

將篩選到的5株菌株進行纖維素酶（濾紙酶）活性測定，結果見表3，CP2菌株的纖維素酶活性高于其他4株菌株，達到136.67 U/mL;其次為CP3菌株，纖維素酶活力為68.69 U/mL;其他3株菌株的酶活性均較低。通過該試驗可以看出，濾紙條降解試驗及酶活性測定試驗結果基本一致。經統計分析表明，除CP1與CP8菌株不存在顯著性差異外，其余菌株均存在顯著性差異。

2.4?堆肥試驗

2.4.1?堆肥過程的溫度變化

溫度是堆肥無害化的重要指標，可直接反映堆體內微生物活性的變化及有機物的轉化情況，因此堆體溫度可直觀、快速地評價堆肥腐熟程度[9]。微生物在分解蠶沙中有機質的同時，會產生大量的熱量，導致堆溫上升。50 ℃以上堆溫保持持續5 d以上，能夠有效地殺滅蠶沙中的致病菌，是保證堆肥無害化的重要條件[10]。從圖1可以看出，試驗組和對照組的堆體溫度都呈現先上升后下降的趨勢，試驗組在堆肥6 d時達到最高溫（65 ℃），其溫度上升速度及最高溫度都優于對照組，且高溫（>50 ℃）持續19 d，比對照組延長了4 d左右，符合堆肥無害化的衛生標準。在堆肥說明加入CP2菌株后可加速堆體升溫，使堆體提前進入高溫期，且持續時間更長，有利于堆肥的腐熟。

2.4.2?堆肥過程中各理化指標變化

2.4.2.1?堆肥過程中含水率變化

堆肥過程中含水率總體呈下降趨勢，微生物的代謝、堆溫等都會對含水率產生影響。從圖2可以看出，試驗組和對照組的含水率均呈現下降趨勢，在高溫階段含水率下降最快，這是由于高溫有利于水分的蒸發。隨著溫度的下降，含水率的下降幅度也隨之放緩，最后試驗組水分降低50%，達到30%，符合有機肥對水分的要求。試驗組比對照組的含水率在高溫期下降更快，降低幅度高出8%，說明加入CP2菌株在增加堆體溫度的同時，也可更好地降低堆體的含水率。

2.4.2.2?堆肥過程中pH值變化

在堆肥過程中，伴隨著含碳有機物被微生物分解產生有機酸和含氮有機物被分解產生氨，堆體的pH值也會隨之發生變化。從圖3可以看出，在堆肥的初始階段，含碳有機物分解產生有機酸，造成pH值下降;隨著堆體溫度上升、含水率下降，含氮有機物分解產生氨氣，使堆體pH值開始上升;后期隨著氨氣的減少以及微生物的降解活動產生大量H+，堆體的pH值又開始回落。至堆體腐熟完畢，其pH值基本穩定在堿性范圍內。試驗組最后的pH值為7.9，對照組為8.1，均符合有機肥規定的pH值為5.5～8.5的標準。在試驗過程中，試驗組的pH值下降和上升趨勢與對照組基本一致，其下降和上升幅度大于對照組，說明加入CP2菌株（試驗組）有利于堆體中有機物的分解。

2.4.2.3?堆肥過程中有機質含量的變化

有機質是來源于生命的物質，是微生物生存的基本物質。堆肥過程一方面可使微生物將有機物降解成礦物質、二氧化碳、水和熱量等而使有機質含量降低[11];另一方面，有機物在降解過程中轉化成穩定的腐殖質，最終使有機質含量趨于穩定。當有機質含量低時，堆肥腐熟過程無法產生足夠的熱量來滿足堆肥對溫度的需要，無法達到腐熟的指標和效果，因而會影響堆肥的肥效;有機質含量過高則對堆肥通風供氧要求較高，若達不到微生物生長對氧的需求，則會導致堆體局部厭氧釋放臭氣。

蠶沙中含有大量的有機質，含量在87%左右。從圖4中可以看出，隨著腐熟天數的增加，有機質含量逐漸下降。試驗組從堆肥5 d時開始有機質含量就出現大幅的下降，到20 d時由最初的87%降低到61%左右，而對照組的有機質含量也發生了下降，但下降幅度較試驗組小，只降低到了70%左右。說明試驗組加入CP2菌株后，加速了蠶沙中有機物的分解，到堆肥結束時，堆肥的有機質含量基本維持在相對穩定的水平。

2.4.2.4?堆肥過程中全氮含量變化

氮素是微生物生長繁殖的主要條件之一，微生物在降解有機物的同時也會影響全氮的含量[12]。從圖5可以看出，試驗組和對照組的全氮含量在腐熟的前10 d呈現下降趨勢，10 d后又逐漸上升，最后穩定在3.21%左右。原因是堆肥腐熟的初始階段，在微生物的作用下有機氮分解轉化成揮發性氮而導致氮含量下降，但是隨著揮發性有機物的分解轉化，堆體的體積和質量均降低，造成全氮含量的絕對值有所下降而相對值卻有所上升。

碳氮比是堆肥腐熟的重要指標，初始腐熟的碳氮比為 （25～30 ）∶1，這是腐熟的理想狀態，而碳氮比到達20 ∶1以下時認為腐熟完成[13]。結合圖4和圖5來看，堆體的初始碳氮比為29 .0∶1，到腐熟完成，試驗組的碳氮比為18.7 ∶1，對照組為21 .0∶1，說明在相同的時間內，加入CP2菌株縮短了堆肥的腐熟時間，也提高了堆肥的腐熟效果。

2.4.3?不同時期的堆肥發芽指數測定

種子發芽試驗可檢驗堆肥的腐熟水平。種子發芽指數>50%表示堆肥基本腐熟;指數達到80%以上則表示堆肥完全腐熟[14]。從圖6可以看出，試驗組腐熟15 d后，其種子發芽指數已達到51%，說明堆肥基本腐熟，比對照組提前了3 d;試驗組腐熟到25 d時，其種子發芽指數達到88%，說明堆肥已完全腐熟，而此時對照組為73%。說明加入CP2菌株能夠加快堆肥的腐熟進程。

3?結論與討論

堆肥是包含一系列生化反應的復雜體系，是在微生物參與下通過高溫發酵使有機物礦質化、腐殖化和無害化而變成腐熟肥料的過程[15]，利用高溫腐熟菌來處理固體廢氣物，可提高腐熟溫度、縮短堆肥周期、提高腐熟度，這已被廣泛證實[16]。

自然界中大部分細菌、真菌、放線菌及原生動物均可產生纖維素酶，因細菌培養簡單、易分離，研究較多。蔣明星等從朽木周圍的土壤中篩選到3株活性較高的纖維素降解細菌并優化了產酶條件[17];羅奉奉等從桑園土壤中篩選到的YZB46菌株，葡萄糖酶活性達到17.08 U/mL[18];馮紅梅等篩選的復合菌群酶活性達到135.9 U/mL[19]。本試驗篩選到的CP2菌株，產酶活性達到136.67 U/mL，優于許多已報道的細菌菌株，甚至達到復合菌群的酶活性，且遠超農業農村部對微生物肥料中纖維素降解菌產纖維素酶活性（70 U/mL）的規定。將該菌株發酵后接種到蠶沙中進行堆肥試驗，結果表明，添加CP2菌株后試驗組堆體最高溫度可達到65 ℃，高溫持續時間比對照組長4 d左右。試驗組和對照組的含水率均出現下降趨勢，但試驗組的含水率在高溫期下降更快，降幅比對照組高出8%;試驗組和對照組的有機質含量隨著腐熟的進行逐漸下降，最終試驗組的有機質含量降低到61%左右，低于對照組;堆體的碳氮比起初為29.0 ∶1，腐熟完成后，試驗組降低到18.7 ∶1，而對照組為21.0 ∶1;試驗組種子發芽指數在腐熟25 d時已達到88%，高于對照組的73%，說明堆肥較對照組更快地達到完全腐熟。以上試驗表明，加入CP2菌株可以加快蠶沙的腐熟進程，提高堆肥的質量。

隨著研究的深入，單一菌株已無法滿足正常生產的需要，研究重點也逐漸轉向復合菌劑，相比較而言，復合菌劑可更快地增加功能菌株的數量、改善堆肥中微生物的群落結構，加強各菌株之間的協同作用，從而縮短堆肥腐熟的時間和提高腐熟度[20]。后續研究將在本研究的基礎上尋找多株高溫腐熟菌，并進行優化配制，構建功能更加完善的復合菌劑，進而為廣西壯族自治區蠶沙的無害化處理提供更有效的方法。

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