噬菌體裂解酶作為抗菌劑的潛在價值

袁玉玉，叢聰，王麗麗,2,4，李曉宇,2,4，李淑英，徐永平,,*

(1 大連理工大學生物工程學院, 遼寧大連 116024；2 動物性食品安全保障技術教育部工程研究中心，遼寧大連 116600；3 大連賽姆生物工程技術公司, 遼寧大連 116620;4 遼寧省大連賽姆噬菌體應用工程技術研究中心，遼寧大連 116600)

抗菌藥物耐藥性(Antimicrobial drug resistance，AMR)是全世界日益增長的挑戰。新的抗性機制的出現及其通過縱向和橫向基因轉移的廣泛分布令人震驚。因此，多重耐藥(MDR)細菌正在全球傳播，且MDR細菌感染的全面影響仍然未知。噬菌體療法作為一項開拓性的醫學創新，在其基礎科學尚未得到初步了解之前就已經開始實施。因此，使用噬菌體作為治療藥物產生了許多問題，尤其是由于對噬菌體生物學缺乏深刻的理解。特別是，與任何抗菌藥物治療一樣，關鍵是使用一些具有一定潛力的制劑，首先在體外，然后在體內，作為靶向微生物的有效拮抗劑，并在其應用中是安全的。噬菌體裂解酶是噬菌體感染宿主晚期表達的一類肽聚糖水解酶。噬菌體裂解酶作為治療制劑具有以下特點：(1)具有高度保守的種屬特異性，不會傷害機體細胞，也不干擾正常的菌群；(2)具有高效、快速的殺菌機制，可在短時間內裂解細菌；(3)不易產生抗性。裂解酶是一種蛋白質分子，不易刺激細菌產生抗性。近年來建立的多種動物感染模型，初步體現了裂解酶用于耐藥細菌感染治療的潛力與優勢。本文將噬菌體裂解酶的結構和功能進行了簡要的介紹，重點綜述了裂解酶作用機制與應用前景。

1 裂解酶結構與作用機制

針對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的裂解酶結構通常是有差異的，這反映了細菌群體之間的細胞壁結構差異。來自革蘭陽性菌的裂解酶已經發展到利用模塊化設計，其中催化活性和底物識別被分別稱為細胞壁結合結構域(cell wall binding domains，CBD)和酶促活性結構域(enzymatically active domains，EAD)的兩種不同類型的功能結構域[1,2,3]。EAD賦予酶的催化機制(即，裂解細菌肽聚糖內的特異性鍵)，但有一些裂解酶的CBD能將蛋白質靶向其底物，并在細胞裂解后保持其緊密結合到細胞壁碎片，從而阻止擴散，以及破壞周圍尚未被噬菌體感染的完整細胞[4]。相比之下，革蘭陰性菌的外膜(outer membrane，OM)可以通過限制裂解酶從外部進入肽聚糖層來防止這類附帶損害，這可能解釋了為什么來自感染革蘭陰性宿主的噬菌體的裂解酶主要是小的單域球狀蛋白(分子量在15到20 kDa之間)，通常沒有特定的CBD模塊[5]。與革蘭陽性菌的裂解酶相比，這類裂解酶可能會更好地發揮酶的催化作用(輔助細胞裂解過程中的多個催化反應)，這類酶結合到一個位點會具有非常低的釋放率[6]。但也有例外情況，據報道，來自假單胞菌噬菌體(KZ144和EL188)的兩種革蘭陰性菌的裂解酶具有N末端CBD和C末端EAD的模塊化結構。N端部分的KZ144以高親和力與銅綠假單胞菌細胞壁結合并識別其他革蘭陰性細菌的PG[7]。另一方面，金黃色陽性的裂解酶主要具有相反的功能模塊取向，其中EAD位于N端，CBD在C端[8-10]。

2 裂解酶的安全性

從安全角度來看，裂解酶的高度特異性是其最有益的特性之一。特別是在食品安全和醫療應用中，這些酶特異性地破壞目標病原體而不影響共生菌群，這一事實使得它們比許多常用的抗生素或化學防腐劑更有優勢。關于人或動物體裂解酶的全身施用，主要關注的是釋放與細菌裂解有關的促炎細胞碎片如磷壁酸、脂磷壁酸和肽聚糖，這可能潛在地導致嚴重的并發癥，例如感染性休克和多器官衰竭[11]。Entenza等發現通過連續靜脈輸注Cpl-1治療的小鼠中促炎性細胞因子濃度增加[12]。而Witzenrath及其同事報道，相同酶在12h內間隔施用時，細胞因子濃度比未處理動物低[13]。這兩個研究之間的差異可能是由于高濃度持續暴露于Cpl-1使細菌細胞壁碎裂增強，導致促炎性分子水平升高[14]。最后，由于它們的蛋白質性質，裂解酶是無腐蝕性和生物可降解的[15]。

3 裂解酶在醫藥方面的應用

細菌可以定殖和感染人體任何部位。因此，裂解酶能夠到達感染部位是重要的。注射裂解酶已成為主要的施用途徑進行應用及研究。目前，有幾種類型的注射已被證明其在動物模型中的功效：靜脈內[16-18]、玻璃體內[19]，腹膜內[20-22]和腦池內[23]。而且，SAL200和CF-301目前都在臨床上II期臨床試驗(表1)注射[24]。注射主要是為了評估在動物模型中治療全身性感染如腦膜炎、心內膜炎、骨髓炎和菌血癥。P128是一種具有抗葡萄球菌活性的嵌合型酶，并已配制成水凝膠[25]。水凝膠由羥乙基纖維素、丙二醇和甘油組成。Abouhmad等[26]將T4裂解酶與纖維素融合模塊用于將裂解酶固定在纖維素紗布材料上，通常用于傷口敷料。融合蛋白保留了其抗革蘭陽性菌的活性，同時不可逆地將裂解酶束縛于敷料紗布上。而且，固定化蛋白質的含量更高、熱穩定性更好和擱置壽命更長。在一項后續研究，作者表明，固定的纖維素納米晶體上的T4裂解酶進一步增強了抗血管生成作用和保質期[27]。

表1 生產裂解酶的公司及臨床研究

4 裂解酶在食品安全中的應用

許多研究已經證明了噬菌體裂解酶用于控制和檢測食源性病原體的可能性。同樣，裂解酶優于其他抗微生物的一大特性是它們對目標病原體具有高度特異性，使食物的天然性和經常需要的細菌菌群保持不變。一個明顯的控制策略是加入純化的裂解酶作為生物防腐劑的食品。Obeso及其同事發現，葡萄球菌噬菌體裂解酶LysH5在巴氏消毒牛奶中迅速殺死金黃色葡萄球菌，在4h內將細菌數量降至檢測水平以下[28]，并與細菌素乳酸鏈球菌素協同作用[29]。據報道裂解酶FCTP1在牛奶或奶制品中有活性[30]。一個有趣的發現是三種李斯特菌噬菌體裂解酶Ply118，Ply511和PlyP35具有高耐熱性，在90℃、30min后仍保持相當大的裂解活性。這些熱穩定酶可用于經過熱處理的食品中，例如巴氏消毒奶制品[31]。噬菌體裂解酶也可在固體食物表面保持抗菌功效，研究顯示，將果實浸泡在產生歐文菌噬菌體裂解酶的大腸埃希菌細胞的裂解物中，能抑制梨上的解淀粉歐文菌的生長[32]。

盡管在食品中的應用尚未得到證實，但已經有報道來自李斯特菌和梭菌噬菌體以及葡萄球菌裂解酶在檢測食品添加劑方面取得了重大進展，使用高親和力的CBD作為標準檢測方法的替代品[33-35]。Kretzer等研究表明，在食物中天然和人為污染與單核細胞增生李斯特菌相比，使用涂有李斯特菌噬菌體CBD的順磁珠，基于CBD的磁分離可以達到＞90%的檢出率[36]。證明該方法在靈敏度和時間要求方面優于標準電鍍程序，并且也適用于檢測其他病原體，如蠟狀芽孢桿菌和產氣莢膜梭菌。此外，有研究已經證明了將這種高度靈敏的技術與實時PCR定量相結合的可能性[37]。將具有不同細胞壁特異性的8種不同的李斯特菌噬菌體裂解酶CBD與各種不同顏色的蛋白偶聯，建立了一套用于血清學菌株特異性對李斯特菌細胞進行顯微檢測和分化的工具集[6]，該方法能夠區分不同的單核細胞增生李斯特菌。基于CBD的檢測方法也被報道用于炭疽桿菌[38,39]。在后者的研究中，裂解酶PlyG的C-末端區域得到的十氨基酸合成肽被證明能夠耦合到熒光QDOT?納米晶體，并足夠能應變特異性檢測炭疽芽孢桿菌替代物。

5 展望

在過去5年中，關于噬菌體裂解酶文獻數量大幅度增加，這些酶在醫學、食品、農業和生物技術領域的應用潛力也得到開發。從醫學角度來看，噬菌體裂解酶特別適用于局部應用的治療方法，從而規避或減少與全身給藥相關的許多潛在風險。然而，最近涉及裂解酶治療動物感染模型的研究提出裂解酶有望在長期全身治療中成為抗生素的合適替代品。