4種長鏈非編碼RNA在重度冠心病患者外周血單個核細胞中的表達及臨床意義

游贛花， 龍向淑， 宋方， 黃晶， 田茂波， 肖燕， 鄧世燕， 吳強**

(1.貴州大學醫學院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省食品藥品檢驗所, 貴州 貴陽 550004； 3.貴州省人民醫院 心內科， 貴州 貴陽 550002； 4.貴州大學人民醫院 心內科， 貴州 貴陽 550002)

冠心病(coronary heart disease, CHD)是嚴重威脅人類健康的重要疾病之一，研究表明，年齡>55歲的CHD患者生存風險高達67%[1]。因此，CHD新診療靶點的尋找及治療方案的優化極其重要。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一類轉錄物長度大于200 nt 、且不具有蛋白編碼功能的非編碼RNA[2-3]，可參與調控多種心血管疾病，如心力衰竭、心肌肥大、心臟梗死和動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發生發展[4-5]。研究表明lncRNA能從體液中穩定地檢測到，并有可能作為CHD非介入診斷的新型生物標志物[6]。因此，本文擬研究重度CHD患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中肺腺癌轉移相關轉錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)、核糖核酸牛磺酸上調基因1(taurine up-regulated 1,TUG1)、Ezrin反義RNA1(ezrin antisense RNA,EZR-AS1)、lncRNA n342419(MANTIS)的表達，分析其在重度CHD中的臨床意義，為重度CHD診斷及治療靶點的尋找提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1一般資料 選取2018年6月-8月經冠狀動脈造影確診CHD、且至少1支主要冠狀動脈血管狹窄>80%的穩定型心絞痛患者(即重度CHD者)作為CHD組，排除標準：(1)不穩定型心絞痛或心肌梗死，(2)合并其他器質性心臟病，(3)合并嚴重肝腎功能障礙、家族性高膽固醇血癥、惡性腫瘤、炎癥性疾病、自身免疫性疾病、活動性肺結核及嚴重精神疾病患者。CHD組共納入患者35例，男24例、女11例，年齡50～75歲、平均(64.59±8.84)歲。選取同期無CHD的體檢人群38例為對照組，男22例、女16例，年齡50～75歲、平均(57.33±6.12)歲。

1.1.2主要試劑和儀器 逆轉錄試劑盒及SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自日本TAKARA公司，血液總RNA快速提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，PCR擴增引物由上海生工生物工程有限公司合成；AU680全自動生化分析儀購自美國Beckman Coulter公司， P05775 PCR儀購自美國Illumina公司。

1.2 方法

1.2.1標本采集 收集所有研究對象的臨床資料，包括性別、年齡、吸煙、飲酒、高血壓、Ⅱ型糖尿病情況等；采集重度CHD患者住院第2天和對照組體檢人群體檢當天的空腹靜脈血8 mL，其中5 mL采用全自動生化分析儀測定總膽固醇(cholesterol ，CHOL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、 低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)等指標，3 mL用于RNA提取。

1.2.2實時定量PCR(RT-qPCR)檢測lncRNA表達 按試劑盒說明書提取PBMC中RNA，逆轉錄成cDNA，采用SYBR Premix Ex TaqTM進行qRT-PCR擴增。PCR擴增條件為：95 ℃、1 min預變性，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，重復循環40次；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，進行熔解曲線分析。以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算所有研究對象MALAT1、TUG1、EZR-AS1、MANTIS在 PBMC中的相對表達量。引物序列見表1。

表1 實驗所用PCR引物序列及擴增片段大小Tab.1 PCR primer sequences

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 臨床特征

CHD組患者HDL-C水平較對照組體檢人群明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)，但2組研究對象間年齡、吸煙、飲酒、高血壓、Ⅱ型糖尿病、CHOL、HDL-C、LDL-C等指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 CHD組患者與對照組體檢者的臨床特征比較Tab.2 Comparison of clinical characteristics between two groups

2.2 lncRNA表達

qRT-PCR檢測結果表明，CHD組患者MALAT1、TUG1、EZR-AS1的表達水平比對照組體檢者明顯升高，但MANTIS的表達則明顯降低，差異均有高度統計學意義(P<0.01)。見圖1。

注：(1)與對照組比較，P<0.01。圖1 lncRNA MALAT1、TUG1、EZR-AS1、MANTIS在對照組和CHD患者PBMC中的表達Fig.1 Expression of lncRNA MALAT1, TUG1, EZR-AS1, and MANTIS in control group and CHD group

2.3 ROC曲線

MALAT1的AUC為0.851，標準誤為0.045，95%CI為0.764～0.938(P<0.01)，靈敏度和特異度分別為80%和78.95%；TUG1的AUC為0.768，標準誤為0.054，95%CI為0.662～0.875(P<0.01)，靈敏度和特異度分別為100%和52.63%；EZR-AS1的AUC為0.884，標準誤為0.037，95%CI為0.811～0.957(P<0.01)，靈敏度和特異度分別為82.86%和78.95%；MANTIS的AUC為0.807，標準誤為0.051，95%CI為0.707～0.907(P<0.01)，靈敏度和特異度分別為94.29%和60.53%。見圖2。

注：A為MALAT1，B為TUG1，C為EZR-AS，D為MANTIS。圖2 lncRNA MALAT1、TUG1、EZR-AS1、MANTIS診斷CHD的ROC 曲線Fig.2 ROC curve of lncRNA MALAT1, TUG1, EZR-AS1, and MANTIS

3 討論

CHD是冠狀動脈粥樣硬化引起心肌缺血缺氧而導致的心臟病，AS是CHD的重要病理生理基礎[7]。隨著轉錄組測序以及生物信息學技術的發展和應用，lncRNA在個體發育和疾病發生過程中的重要作用引起了關注[8]。2012年，美國食品藥品監督管理局授權lncRNA前列腺癌抗原3(第一個應用于臨床的非編碼RNA)用于前列腺癌臨床診斷。靶向lncRNA不僅適用于腫瘤，同樣適用于心血管疾病[9]。研究顯示，lncRNA可通過抑制人主動脈平滑肌細胞的增殖、遷移以及調節層流剪切力等機制，發揮抗AS作用[10-11]。因此，定義lncRNA的功能可能有助于識別CHD的新的診斷和治療靶點。

MALAT1轉錄本在人類中長約7 kb，位于人類染色體11q13位置上，是在多種癌癥中過度表達的lncRNA，其高表達與腫瘤生長、轉移相關[12-13]。同時，有研究發現MALAT1與AS亦密切相關，用ox-LDL處理的內皮細胞缺失外泌體MALAT1時可促進AS的形成，而敲低MALAT1表達對小鼠AS進展起抑制作用[14-15]。一般情況下，1支或1支以上主要冠狀動脈狹窄程度達到50%即可診斷為CHD[16]。本研究選用冠脈狹窄>80%的患者血液，擬篩選出與CHD嚴重程度相關的lncRNA。結果表明，MALAT1在CHD患者PBMC中高表達(P<0.01)，AUC為0.851，95%CI為0.764～0.938，靈敏度和特異度分別為80%、78.95%，表明MALAT1對重度CHD的診斷具有較高的靈敏度和特異度。

TUG1轉錄本長7.1 kb，位于人類染色體22q12.2位置上，最初在牛磺酸處理的小鼠視網膜細胞中發現[17]。研究發現TUG1與AS的發生相關，如TUG1可通過上調miR-26a的表達來抑制apoE-/-小鼠AS損傷的形成[18]；TUG1在主動脈瓣鈣化過程中可通過上調runx2促進成骨細胞分化[19]。本研究發現，TUG1在CHD患者PBMC中高表達(P<0.01)，AUC為0.768，95%CI為0.662～0.875，靈敏度和特異度分別為100%、52.63%，由此可知，TUG1診斷重度CHD具有較高的靈敏度，但特異度較低，這可能與高血壓、心肌纖維化等心血管疾病都會引起TUG1表達異常有關[20-21]。

EZR-AS1是一個新型的lncRNA，最初被發現在人食管癌組織中高表達，并可通過上調EZR表達促進癌細胞遷移[22]。本研究發現EZR-AS1在CHD患者PBMC中高表達(P<0.01)，AUC為0.884，95%CI為0.811～0.957，靈敏度和特異度分別為82.86%、78.95%，提示EZR-AS1對重度CHD的診斷具有較高的靈敏度和特異度。

MANTIS是一種具有促進內皮血管生成功能的新型lncRNA，研究表明MANTIS參與了層流及他汀類藥物誘導的信號轉導并發揮內皮保護作用，同時層流及他汀類藥物均可增加MANTIS的表達，提示MANTIS具有抗AS作用[23-24]。本實驗結果顯示MANTIS在CHD患者PBMC中低表達(P<0.01)，AUC為0.807，95%CI為0.707～0.907，靈敏度和特異度分別為94.29%、60.53%，由此可知，TUG1診斷重度CHD具有較高的靈敏度，但特異度不高，可能與其他心血管疾病會引起MANTIS表達異常有關，具體原因有待進一步探索。

綜上所述，本研究結果提示MALAT1、TUG1、EZR-AS1、MANTIS在重度CHD患者PBMC中差異性表達，與CHD嚴重程度相關，具有成為CHD診斷及病情評估生物標志物的潛能。